Бемории Алтсгеймер (AD) биомаркерҳои сафеда надорад, ки патофизиологияи сершумори онро инъикос мекунанд ва ба пешрафти ташхис ва табобат халал мерасонанд. Дар ин ҷо, мо протеомикаи ҳамаҷонибаро барои муайян кардани биомаркерҳои моеъи мағзи сар (CSF) истифода мебарем, ки доираи васеи патофизиологияи AD-ро намояндагӣ мекунанд. Масс-спектрометрияи мултиплекс тақрибан 3,500 ва тақрибан 12,000 сафедаҳоро дар AD CSF ва майна муайян кард. Таҳлили шабакаи протеомаи мағзи сар 44 модули гуногунии биологиро ҳал кард, ки 15-тои онҳо бо протеомаи моеъи мағзи сар ба ҳам мепайвандад. Нишондиҳандаҳои CSF AD дар ин модулҳои такроршаванда ба панҷ гурӯҳи сафедаҳо ҷамъ шудаанд, ки равандҳои гуногуни патофизиологиро намояндагӣ мекунанд. Синапсҳо ва метаболитҳо дар майнаи AD кам мешаванд, аммо CSF меафзояд, дар ҳоле ки миелинизатсияи аз глиалӣ бой ва гурӯҳҳои иммунӣ дар майна ва CSF меафзояд. Пайвастагӣ ва хосияти бемории тағйироти панел дар зиёда аз 500 намунаҳои иловагии CSF тасдиқ карда шуданд. Ин гурӯҳҳо инчунин зергурӯҳҳои биологиро дар AD асимптоматикӣ муайян карданд. Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо як қадами умедбахш дар самти абзорҳои биомаркерии веб барои барномаҳои клиникӣ дар AD мебошанд.
Бемории Алтсгеймер (AD) сабаби маъмултарини деменцияи нейродегенеративӣ дар саросари ҷаҳон аст ва бо доираи васеи дисфунксияҳои системаи биологӣ, аз ҷумла интиқоли синаптикӣ, иммунитети глиалӣ ва мубодилаи митохондриалӣ тавсиф мешавад (1-3). Аммо, биомаркерҳои муқарраршудаи сафедаи он то ҳол ба ошкор кардани протеини амилоид ва тау тамаркуз мекунанд ва аз ин рӯ ин патофизиологияи гуногунро инъикос карда наметавонанд. Ин биомаркерҳои сафедаи "аслӣ", ки дар моеъи мағзи сар (CSF) ба таври эътимодбахш чен карда мешаванд, иборатанд аз (i) амилоиди бета пептид 1-42 (Aβ1-42), ки ташаккули лавҳаҳои амилоиди кортикалиро инъикос мекунад; (ii) тотал tau, аломати таназзули аксон; (iii) фосфо-тау (п-тау), намояндаи гиперфосфоризатсияи патологии тау (4-7). Гарчанде ки ин биомаркерҳои моеъи мағзи сар ба мо барои ошкор кардани бемориҳои сафедаи "таъйидшуда"-и AD (4-7) мусоидат карданд, онҳо танҳо як қисми хурди биологияи мураккаби паси бемориро намояндагӣ мекунанд.
Набудани гуногунии патофизиологии биомаркерҳои AD боиси мушкилоти зиёд шудааст, аз ҷумла (i) нотавонӣ барои муайян кардан ва муайян кардани гетерогении биологии беморони AD, (ii) ченкунии нокифояи шиддат ва пешрафти беморӣ, махсусан дар марҳилаи пеш аз клиникӣ, Ва ( iii) таҳияи доруҳои табобатӣ, ки натавонистанд тамоми ҷанбаҳои бадшавии неврологиро пурра ҳал кунанд. Вобастагии мо ба патологияи муҳим барои тавсифи AD аз бемориҳои алоқаманд ин мушкилотро боз ҳам шадидтар мекунад. Бештар ва бештар далелҳо нишон медиҳанд, ки аксари пиронсолони гирифтори деменсия зиёда аз як хусусияти патологии пастшавии маърифатӣ доранд (8). Тақрибан 90% ё бештар аз шахсони гирифтори патологияи AD низ бемории рагҳо, дохилшавии TDP-43 ё дигар бемориҳои degenerative доранд (9). Ин таносуби баланди такрори патологӣ чаҳорчӯбаи ташхиси кунунии моро барои деменсия халалдор кардааст ва таърифи ҳамаҷонибаи патофизиологии ин беморӣ лозим аст.
Бо дарназардошти эҳтиёҷоти фаврӣ ба биомаркерҳои гуногуни AD, соҳа торафт бештар усули “омикс”-ро дар асоси системаи умумӣ барои кашф кардани биомаркерҳо истифода мебарад. Шарикии суръатбахшии фармасевтӣ (AMP)-AD Alliance дар соли 2014 оғоз шуда буд ва дар сафи пеши барнома қарор дорад. Ин кӯшиши бисёрсоҳаи Донишкадаҳои Миллии Тандурустӣ, академия ва саноат ҳадафи истифодаи стратегияҳои системавӣ барои беҳтар муайян кардани патофизиологияи AD ва таҳияи таҳлили ташхис ва стратегияҳои гуногунии биологӣ мебошад (10). Дар доираи ин лоиҳа, протеомикаи шабака як воситаи умедбахш барои пешрафти биомаркерҳои системавӣ дар AD гардид. Ин равиши беғаразона, ки ба маълумот асос ёфтааст, маҷмӯаҳои мураккаби протеомикиро ба гурӯҳҳо ё "модулҳо" -и сафедаҳои муштарак ифода мекунанд, ки бо намудҳои мушаххаси ҳуҷайраҳо, органеллҳо ва функсияҳои биологӣ алоқаманданд (11-13). Тақрибан 12 тадқиқоти протеомикаи шабакаҳои иттилоотӣ дар мағзи AD гузаронида шуданд (13-23). Дар маҷмӯъ, ин таҳлилҳо нишон медиҳанд, ки протеомаи шабакаи мағзи сари AD як созмони модули хеле ҳифзшударо дар когортҳои мустақил ва минтақаҳои сершумори кортикалӣ нигоҳ медорад. Илова бар ин, баъзе аз ин модулҳо тағироти такроршавандаро дар фаровонии марбут ба AD дар маҷмӯи маълумот нишон медиҳанд, ки патофизиологияи бемориҳои гуногунро инъикос мекунанд. Дар маҷмӯъ, ин бозёфтҳо нуқтаи умедбахшро барои кашфи протеоми шабакаи мағзи сар ҳамчун биомаркери ба система асосёфта дар AD нишон медиҳанд.
Барои табдил додани протеомаи шабакаи мағзи сар ба биомаркерҳои дар асоси система асосёфтаи клиникӣ, мо шабакаи аз мағзи сар гирифташударо бо таҳлили протеомикии AD CSF муттаҳид кардем. Ин равиши ҳамгирошуда ба муайян кардани панҷ маҷмӯи умедбахши биомаркерҳои CSF оварда расонд, ки бо доираи васеи патофизиологияи мағзи сар, аз ҷумла синапсҳо, рагҳои хун, миелинизатсия, илтиҳоб ва дисфунксияи роҳҳои метаболикӣ алоқаманданд. Мо ин панелҳои биомаркерро тавассути таҳлилҳои сершумори такрорӣ, аз ҷумла зиёда аз 500 намунаҳои CSF аз бемориҳои гуногуни нейродегенеративӣ бомуваффақият тасдиқ кардем. Ин таҳлилҳои тасдиқкунӣ аз баррасии ҳадафҳои гурӯҳӣ дар CSF-и беморони гирифтори AD (AsymAD) ё нишон додани далелҳои ҷамъшавии ғайримуқаррарии амилоид дар муҳити муқаррарии маърифатӣ иборатанд. Ин таҳлилҳо гетерогении назарраси биологиро дар популятсияи AsymAD таъкид мекунанд ва аломатҳои панелро муайян мекунанд, ки метавонанд шахсони алоҳидаро дар марҳилаҳои аввали беморӣ муайян кунанд. Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо як қадами калидӣ дар таҳияи абзорҳои биомаркери сафеда дар асоси системаҳои сершумор мебошанд, ки метавонанд бисёре аз мушкилоти клиникиро, ки бо AD дучор мешаванд, бомуваффақият ҳал кунанд.
Мақсади асосии ин тадқиқот муайян кардани биомаркерҳои нави моеъи мағзи сар мебошад, ки патофизиологияи гуногуни мағзи сарро инъикос мекунанд, ки ба AD оварда мерасонанд. Тасвири S1 методологияи тадқиқоти моро дар бар мегирад, ки (i) таҳлили ҳамаҷониба тавассути бозёфтҳои пешакии AD CSF ва протеомаи мағзи сар барои муайян кардани биомаркерҳои сершумори бемории CSF марбут ба майна ва (ii) такрори минбаъдаи ин биомаркерҳо дар якчанд мағзи сарҳои мустақил мебошанд. гурӯҳҳои моеъ. Тадқиқоти ба кашф нигаронидашуда бо таҳлили ифодаи дифференсиалии CSF дар 20 шахсони аз ҷиҳати маърифатӣ муқаррарӣ ва 20 беморони AD дар Маркази тадқиқоти бемории Алтсгеймер (ADRC) оғоз ёфт. Ташхиси AD ҳамчун нуқсони назарраси маърифатӣ ҳангоми мавҷудияти пасти Aβ1-42 ва баландшавии сатҳи умумии tau ва p-tau дар моеъи мағзи сар муайян карда мешавад [Арзёбии когнитивии Монреал (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Ҷадвали S1A). Назорат (ба ҳисоби миёна MoCA, 26,7 ± 2,2) сатҳи муқаррарии биомаркерҳои CSF дошт.
CSF-и инсон бо диапазони динамикии фаровонии сафедаҳо тавсиф карда мешавад, ки дар он альбумин ва дигар сафедаҳои хеле фаровон метавонанд аз ошкор кардани сафедаҳои манфиатдор пешгирӣ кунанд (24). Барои баланд бардоштани амиқи кашфи сафедаҳо, мо 14 сафедаи фаровони аввалинро аз ҳар як намунаи CSF пеш аз таҳлили масс-спектрометрӣ (MS) хориҷ кардем (24). Дар маҷмӯъ 39,805 пептидҳо аз ҷониби MS муайян карда шуданд, ки дар 40 намуна ба 3691 протеомҳо харита карда шуданд. Миқдори сафедаҳо тавассути тамғагузории сершумори тандемии масса (TMT) анҷом дода мешавад (18, 25). Барои ҳалли маълумоти гумшуда, мо танҳо он сафедаҳоро дохил кардем, ки ҳадди аққал дар 50% намунаҳо дар таҳлили минбаъда миқдори муайян карда шуда буданд ва дар ниҳоят миқдори 2875 протеомаро муайян кардем. Аз сабаби фарқияти назаррас дар сатҳи фаровонии умумии сафедаҳо, намунаи назоратӣ аз ҷиҳати оморӣ аз ҳад зиёд ҳисобида шуд (13) ва ба таҳлили минбаъда дохил карда нашуд. Қиматҳои фаровонии 39 намунаи боқимонда вобаста ба синну сол, ҷинс ва коварианси партия (13-15, 17, 18, 20, 26) тасҳеҳ карда шуданд.
Бо истифода аз таҳлили омории t-test барои арзёбии ифодаи дифференсиалӣ дар маҷмӯи додаҳои регрессия, ин таҳлил сафедаҳоеро муайян кард, ки сатҳи фаровонии онҳо дар байни ҳолатҳои назорат ва AD (Ҷадвали S2A) ба таври назаррас тағир ёфтааст (P <0.05). Чунон ки дар расми 1А нишон дода шудааст, фаровонии умумии 225 сафеда дар АД хеле кам шуд ва фаровонии 303 сафеда хеле зиёд шуд. Ин сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда якчанд аломатҳои қаблан муайяншудаи моеъи мағзи сарро дар бар мегиранд, аз қабили протеини бо микротубула алоқаманд (MAPT; P = 3.52 × 10−8), нейрофиламент (NEFL; P = 6.56 × 10−3), протеини ба афзоиш алоқаманд 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Протеини пайвасткунандаи кислотаи равғанӣ 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Хитиназа 3 монанди 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Гранулини асабӣ (NRGN; P = 3.43 × 10−4) ва омили афзоиши асаби VGF (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Бо вуҷуди ин, мо инчунин дигар ҳадафҳои хеле муҳимро муайян кардем, ба монанди ингибитори диссоциатсияи ММД 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) ва пайвастагии модулии калсий 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) . Таҳлили Ген Онтология (GO) аз 225 сафедаҳои ба таври назаррас коҳишёфта робитаи зичро бо равандҳои моеъи бадан, аз қабили мубодилаи стероидҳо, коагулятсияи хун ва фаъолияти гормонҳо ошкор кард (Расми 1B ва Ҷадвали S2B). Баръакс, сафедаи ба таври назаррас афзоишёфтаи 303 бо сохтори ҳуҷайра ва мубодилаи энергия зич алоқаманд аст.
(A) Нақшаи вулқон тағирёбии 2 маротиба (х-меҳвар)-ро нисбат ба арзиши омории -log10 P (y-меҳвар), ки тавассути санҷиши t ба даст омадааст, нишон медиҳад, ки барои муайян кардани ифодаи дифференсиалӣ байни назорат (CT) ва Ҳолатҳои AD аз протеоми CSF Аз ҳама сафедаҳо. Сафедаҳое, ки сатҳи ба таври назаррас коҳишёфта (P <0,05) дар AD бо ранги кабуд нишон дода шудаанд, дар ҳоле ки сафедаҳои дорои сатҳи ба таври назаррас баланд дар беморӣ бо ранги сурх нишон дода шудаанд. Протеини интихобшуда нишон дода шудааст. (B) Дар AD истилоҳоти болоии GO марбут ба сафеда ба таври назаррас коҳиш (кабуд) ва зиёд (сурх) мебошанд. Се истилоҳи GO-ро бо z-холҳои баландтарин дар соҳаҳои равандҳои биологӣ, функсияҳои молекулавӣ ва ҷузъҳои ҳуҷайра нишон медиҳад. (C) MS сатҳи MAPT-ро дар намунаи CSF чен кард (аз чап) ва таносуби он бо сатҳи ELISA tau (аз рост). Коэффисиенти коррелятсияи Пирсон бо арзиши мувофиқи P нишон дода мешавад. Аз сабаби набудани маълумоти ELISA барои як ҳолати AD, ин рақамҳо арзишҳои 38 аз 39 ҳолати таҳлилшударо дар бар мегиранд. (D) Таҳлили кластери назоратшаванда (P <0,0001, Бенҷамини-Хочберг (BH) тасҳеҳшуда P <0,01) дар назорат ва AD CSF намунаҳоро бо истифода аз 65 сафедаи ба таври назаррас тағйирёфта дар маҷмӯи маълумот ёфтанд. Стандарт кардан, нормал кардан.
Сатҳи протеомии MAPT бо сатҳи мустақилона чен кардашудаи ELISA tau (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Расми 1C) зич алоқаманд аст, ки дурустии андозагирии MS-и моро дастгирӣ мекунад. Пас аз ҳозимаи трипсин дар сатҳи сафедаи пешгузаштаи амилоид (APP), пептидҳои хоси изоформ, ки ба C-терминуси Aβ1-40 ва Aβ1-42 оварда шудаанд, наметавонанд самаранок ионизатсия шаванд (27, 28). Аз ин рӯ, пептидҳои APP, ки мо муайян кардем, бо сатҳҳои ELISA Aβ1-42 ҳеҷ иртиботе надоранд. Барои арзёбии ифодаи дифференсиалии ҳар як ҳолат, мо сафедаҳои дифференсиалӣ ифодашударо бо P <0,0001 [сатҳи кашфи бардурӯғ (FDR) ислоҳшудаи P <0,01] барои анҷом додани таҳлили кластерии назоратшавандаи намунаҳо истифода кардем (Ҷадвали S2A). Тавре ки дар расми 1D нишон дода шудааст, ин 65 сафедаи хеле муҳим метавонанд намунаҳоро мувофиқи ҳолати беморӣ дуруст кластер кунанд, ба истиснои як ҳолати AD бо хусусиятҳои ба назорат монанд. Аз ин 65 сафеда, 63-тоаш дар AD зиёд шуд, дар ҳоле ки танҳо дуто (CD74 ва ISLR) кам шуданд. Дар маҷмӯъ, ин таҳлилҳои моеъи мағзи сар садҳо сафедаҳоро дар AD муайян карданд, ки метавонанд ҳамчун биомаркерҳои беморӣ хидмат кунанд.
Сипас, мо таҳлили мустақили шабакаи протеоми мағзи сарро анҷом додем. Когорти мағзи ин кашфиёт кортекси dorsolateral prefrontal (DLPFC) аз назорат (n = 10), бемории Паркинсон (PD; n = 10), омехтаи AD/PD (n = 10) ва AD (n = 10) ҳолатҳоро дар бар мегирад. ) Намуна. Эмери Гоизуэта ADRC. Демографии ин 40 ҳолат қаблан тавсиф шуда буд (25) ва дар ҷадвали S1B ҷамъбаст карда шудаанд. Мо TMT-MS-ро барои таҳлили ин 40 бофтаҳои майна ва когорти репликатсияи 27 ҳолат истифода бурдем. Дар маҷмӯъ, ин ду маҷмӯаи маълумоти мағзи сар 227,121 пептидҳои беназирро ба вуҷуд оварданд, ки ба 12,943 протеомаҳо харита карда шудаанд (25). Танҳо он сафедаҳое, ки ҳадди аққал дар 50% ҳолатҳо миқдорашон муайян карда шудаанд, ба таҳқиқоти минбаъда дохил карда шуданд. Маҷмӯи маълумоти охирини кашфиёт дорои 8817 сафедаи миқдорӣ мебошад. Сатҳи фаровонии сафедаҳоро вобаста ба синну сол, ҷинс ва фосилаи пас аз марг (PMI) танзим кунед. Таҳлили ифодаи дифференсиалии маҷмӯи маълумот пас аз регрессия нишон дод, ки> 2000 сатҳи сафеда ба таври назаррас тағйир ёфт [P <0.05, таҳлили дисперсия (ANOVA)] дар ду ё зиёда гурӯҳи беморӣ. Сипас, мо таҳлили кластери назоратшавандаро дар асоси сафедаҳои дифференсиалӣ ифодашуда ва P <0.0001 дар муқоисаи AD/control ва/ё AD/PD анҷом додем (Тасвири S2, A ва B, Ҷадвали S2C). Ин 165 сафедаи хеле тағирёфта ҳолатҳои патологияи AD-ро аз намунаҳои назорат ва PD ба таври возеҳ тасвир мекунанд, ки тағироти қавии хоси AD дар тамоми протеомро тасдиқ мекунанд.
Пас аз он мо як алгоритми бо номи Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) -ро барои анҷом додани таҳлили шабакавӣ дар протеоми кашфшудаи майна истифода бурдем, ки маҷмӯи маълумотро ба модулҳои сафеда бо намунаҳои шабеҳи ифода ташкил мекунад (11-13). Таҳлил 44 модул (M) сафедаҳои муштарак ифодашударо муайян кард, ки аз калонтарин (M1, n = 1821 сафеда) то хурдтарин (M44, n = 34 сафеда) мураттаб ва рақамгузорӣ карда шудаанд (Расми 2А ва Ҷадвали S2D)). Тавре ки дар боло зикр гардид (13) Профили ифодакунандаи ифода ё сафедаи хоси ҳар як модулро ҳисоб кунед ва онро бо ҳолати беморӣ ва патологияи AD алоқаманд кунед, яъне иттиҳоди Феҳристи бемориҳои Алтсгеймер (CERAD) ва Холи Браакро таъсис диҳед (Расми 2B). Дар маҷмӯъ, 17 модул ба таври назаррас ба невропатологияи AD алоқаманд буданд (P <0.05). Бисёре аз ин модулҳои марбут ба беморӣ инчунин аз маркерҳои мушаххаси навъи ҳуҷайра бой мебошанд (Расми 2B). Тавре ки дар боло зикр гардид (13), ғанисозии навъи ҳуҷайра тавассути таҳлили такрори модул ва рӯйхати истинодҳои генҳои хоси навъи ҳуҷайра муайян карда мешавад. Ин генҳо аз маълумоти нашршуда дар нейронҳои ҷудошудаи муш, ҳуҷайраҳои эндотелия ва глиалӣ гирифта шудаанд. Таҷрибаи пайдарпайии RNA (RNA-seq) (29).
(A) WGCNA-и протеомаи майнаро кашф кунед. (B) Таҳлили коррелятсияи миёнавазни дувазн (BiCor) протеини имзои модулӣ (як ҷузъи асосии ифодаи сафедаи модулӣ) бо хусусиятҳои невропатологии AD (боло), аз ҷумла холҳои CERAD (Plaque Aβ) ва Braak (tau tangles). Шиддати таносуби мусбат (сурх) ва манфи (кабуд) бо харитаи гармии ду ранг нишон дода шудааст ва ситорачаҳо аҳамияти оморӣ доранд (Р <0,05). Санҷиши дақиқи Hypergeometric Fisher's Exact (FET) (поён) -ро барои арзёбии ассотсиатсияи навъи ҳуҷайраҳои ҳар як модули сафеда истифода баред. Шиддати сояҳои сурх дараҷаи ғанӣ шудани навъи ҳуҷайра ва ситорача аҳамияти оморӣ (P <0,05) -ро нишон медиҳад. Усули BH-ро барои ислоҳ кардани арзиши P, ки аз FET гирифта шудааст, истифода баред. $C) GO таҳлили сафедаҳои модулӣ. Барои ҳар як модул ё гурӯҳи модулҳои алоқаманд равандҳои биологии зич алоқаманд нишон дода шудаанд. олиго, олигодендросит.
Маҷмӯи панҷ модули ба ҳам зич алоқаманд астроситҳо ва бойи микроглия (M30, M29, M18, M24 ва M5) иртиботи қавии мусбатро бо невропатологияи AD нишон доданд (Расми 2B). Таҳлили онтология ин модулҳои глиалиро бо афзоиши ҳуҷайраҳо, паҳншавӣ ва масуният мепайвандад (Расми 2C ва Ҷадвали S2E). Ду модули иловагии глиалӣ, M8 ва M22, инчунин дар беморӣ сахт танзим карда мешаванд. M8 бо роҳи ретсепторҳои ба монанди пулакӣ алоқаманд аст, як каскади сигнализатсия, ки дар аксуламали иммунии модарзод нақши калидӣ дорад (30). Дар айни замон, M22 бо тағироти пас аз тарҷума алоқаманд аст. M2, ки аз олигодендроситҳо бой аст, иртиботи қавии мусбати патологии AD ва иртиботи онтологиро бо синтези нуклеозидҳо ва репликатсияи ДНК нишон медиҳад, ки афзоиши паҳншавии ҳуҷайраҳоро дар бемориҳо нишон медиҳад. Дар маҷмӯъ, ин бозёфтҳо болоравии модулҳои глиалиро дастгирӣ мекунанд, ки мо қаблан дар протеоми шабакаи AD мушоҳида кардаем (13, 17). Дар айни замон муайян карда шудааст, ки бисёре аз модулҳои глиалии марбут ба AD дар шабака сатҳи пасти ифодаро дар ҳолатҳои назорат ва PD нишон медиҳанд, ки хусусияти бемории онҳоро, ки дар AD баланд аст, таъкид мекунанд (Тасвири S2C).
Танҳо чор модул дар протеоми шабакаи мо (M1, M3, M10 ва M32) бо патологияи AD (P <0.05) ба таври манфӣ алоқаманданд (Расми 2, B ва C). Ҳарду M1 ва M3 аз маркерҳои нейронӣ бой мебошанд. M1 бо сигналҳои синаптикӣ хеле алоқаманд аст, дар ҳоле ки M3 бо функсияи митохондриалӣ зич алоқаманд аст. Ягон далели ғанисозии навъи ҳуҷайра барои M10 ва M32 вуҷуд надорад. M32 робитаи байни M3 ва мубодилаи ҳуҷайраҳоро инъикос мекунад, дар ҳоле ки M10 бо афзоиши ҳуҷайра ва функсияи микротубулҳо алоқаманд аст. Дар муқоиса бо AD, ҳамаи чор модулҳо дар назорат ва PD зиёд карда шудаанд, ки ба онҳо тағйироти хоси бемории AD медиҳад (Тасвири S2C). Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо кам шудани миқдори модулҳои бойи нейронро, ки мо қаблан дар AD мушоҳида карда будем, дастгирӣ мекунанд (13, 17). Хулоса, таҳлили шабакаи протеомаи мағзи сар, ки мо кашф кардем, модулҳои ба таври мушаххас тағйирёфтаи AD истеҳсол карда шуданд, ки бо бозёфтҳои қаблии мо мувофиқанд.
AD бо марҳилаи барвақти асимптоматикӣ (AsymAD) тавсиф мешавад, ки дар он одамон ҷамъшавии амилоидҳоро бидуни коҳиши маърифатии клиникӣ нишон медиҳанд (5, 31). Ин марҳилаи асимптоматикӣ як равзанаи муҳим барои ошкор ва дахолати бармаҳал мебошад. Мо қаблан нигоҳдории қавии модулии протеомаи шабакаи мағзи AsymAD ва ADро дар маҷмӯи маълумотҳои мустақил нишон дода будем (13, 17). Барои он ки шабакаи мағзие, ки мо ҳоло кашф кардем, бо ин бозёфтҳои қаблӣ мувофиқат кунад, мо нигоҳдории 44 модулро дар маҷмӯи маълумоти такрорӣ аз 27 ташкилоти DLPFC таҳлил кардем. Ба ин ташкилотҳо ҳолатҳои назоратӣ (n = 10), AsymAD (n = 8) ва AD (n = 9) дохил мешаванд. Намунаҳои назорат ва AD ба таҳлили когорти мағзи кашфи мо дохил карда шуданд (Ҷадвали S1B), дар ҳоле ки ҳолатҳои AsymAD танҳо дар когорти такрорӣ беназир буданд. Ин парвандаҳои AsymAD инчунин аз бонки мағзи сари Emory Goizueta ADRC омадаанд. Гарчанде ки маърифат ҳангоми марг муқаррарӣ буд, сатҳи амилоидҳо ба таври ғайримуқаррарӣ баланд буданд (ба ҳисоби миёна CERAD, 2,8 ± 0,5) (Ҷадвали S1B).
Таҳлили TMT-MS аз ин 27 бофтаи мағзи сар боиси миқдори 11,244 протеома гардид. Ин ҳисобкунии ниҳоӣ танҳо он сафедаҳоро дар бар мегирад, ки дар ҳадди аққал 50% намунаҳо миқдорашон муайян карда шудаанд. Ин маҷмӯаи маълумоти такрорӣ 8638 (98,0%) аз 8817 сафедаи дар таҳлили мағзи кашфшудаи мо муайяншударо дар бар мегирад ва тақрибан 3000 протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфтаро дар байни когортҳои назорат ва AD дорад (P <0,05, пас аз санҷиши ҷуфтшудаи Tukey барои таҳлили дисперсия) ( Ҷадвали S2F). Дар байни ин сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда, 910 инчунин тағироти назарраси сатҳи байни AD ва ҳолатҳои назорати протеоми мағзи сарро нишон дод (P <0.05, пас аз ANOVA Tukey ҷуфтшудаи t-test). Қобили зикр аст, ки ин 910 маркерҳо дар самти тағирёбии байни протеомаҳо мувофиқат мекунанд (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Расми S3A). Дар байни сафедаҳои афзоишёфта, сафедаҳо бо тағироти пайваста дар байни маҷмӯи додаҳо асосан аъзои модулҳои аз глиалӣ бой M5 ва M18 мебошанд (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 ва GFAP). Дар байни протеинҳои камшуда, онҳое, ки тағироти устувортарин доштанд, тақрибан танҳо аъзои модули M1 (NPTX2, VGF ва RPH3A) буданд, ки бо синапс алоқаманданд. Мо минбаъд тағиротҳои марбут ба AD-ро дар миқёси миёна (MDK), CD44, протеини 1 алоқаманд (SFRP1) ва VGF-ро тавассути blotting ғарбӣ тафтиш кардем (Тасвири S3B). Таҳлили нигоҳдории модул нишон дод, ки тақрибан 80% модулҳои сафеда (34/44) дар протеомаи мағзи сар дар маҷмӯи маълумоти такрорӣ нигоҳ дошта шудаанд (z-хол> 1,96, FDR ислоҳшуда P <0,05) (Расми S3C). Чордаҳ аз ин модулҳо дар байни ду протеома махсус ҳифз шудаанд (z-score> 10, FDR ислоҳшуда P <1.0 × 10−23). Дар маҷмӯъ, кашф ва такрори дараҷаи баланди мувофиқат дар ифодаи дифференсиалӣ ва таркиби модулӣ байни протеоми майна такроршавандагии тағиротро дар сафедаҳои кортекси фронталии AD таъкид мекунад. Илова бар ин, он инчунин тасдиқ кард, ки AsymAD ва бемориҳои пешрафта сохтори шабакаи мағзи сар доранд.
Таҳлили муфассали ифодаи дифференсиалӣ дар маҷмӯи маълумоти такрории мағзи сар дараҷаи назарраси тағирёбии сафедаи AsymAD, аз ҷумла дар маҷмӯъ 151 сафедаи ба таври назаррас тағирёфтаро байни AsymAD ва назорат (P <0,05) нишон медиҳад (Расми S3D). Мувофиқи сарбории амилоид, APP дар мағзи AsymAD ва AD ба таври назаррас афзоиш ёфт. MAPT танҳо дар AD ба таври назаррас тағир меёбад, ки ба баланд шудани сатҳи печидаҳо ва таносуби маълуми он бо таназзули маърифатӣ мувофиқ аст (5, 7). Модулҳои аз глиалӣ бой (M5 ва M18) дар афзоиши сафедаҳо дар AsymAD хеле инъикос карда мешаванд, дар ҳоле ки модули M1 вобаста ба нейрон намояндаи бештари сафедаҳои камшуда дар AsymAD мебошад. Бисёре аз ин маркерҳои AsymAD дар бемориҳои симптоматикӣ тағйироти бештар нишон медиҳанд. Дар байни ин нишонаҳо SMOC1, протеини глиалии мутааллиқ ба M18 мебошад, ки бо варамҳои майна ва рушди чашмҳо ва дасту пойҳо алоқаманд аст (32). MDK як омили афзоиши гепарин аст, ки ба афзоиши ҳуҷайра ва ангиогенез алоқаманд аст (33), узви дигари M18. Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, AsymAD ба таври назаррас афзоиш ёфт ва пас аз он афзоиши бештари AD афзоиш ёфт. Баръакси ин, протеини синаптикии нейропентраксин 2 (NPTX2) дар мағзи AsymAD ба таври назаррас коҳиш ёфт. NPTX2 қаблан бо нейродегенератсия алоқаманд буд ва дар миёнаравии синапсҳои ҳаяҷоновар нақши эътирофшуда дорад (34). Умуман, ин натиҷаҳо тағироти гуногуни сафедаи пеш аз клиникиро дар AD нишон медиҳанд, ки бо шиддатнокии беморӣ пешрафт мекунанд.
Бо назардошти он, ки мо дар кашфи протеомаи мағзи сар ба умқи назарраси фарогирии сафеда ноил шудаем, мо кӯшиш мекунем, ки мувофиқати онро бо транскриптомҳои сатҳи шабакавии AD пурратар фаҳмем. Аз ин рӯ, мо протеомаи мағзиеро, ки мо кашф кардем, бо модуле, ки қаблан аз андозагирии микроаррейи 18,204 ген дар AD (n = 308) ва назорат (n = 157) бофтаҳои DLPFC тавлид карда будем, муқоиса кардем (13). такроршаванда. Дар маҷмӯъ, мо 20 модули гуногуни РНК-ро муайян кардем, ки бисёре аз онҳо ғанисозии намудҳои мушаххаси ҳуҷайраҳо, аз ҷумла нейронҳо, олигодендроситҳо, астроцитҳо ва микроглияро нишон доданд (Расми 3А). Тағироти сершумори ин модулҳо дар AD дар расми 3B нишон дода шудаанд. Мувофиқи таҳлили такрори сафедаи РНК-и қаблии мо бо истифода аз протеоми амиқтари тамғанашудаи MS (тақрибан 3000 сафеда) (13), аксари 44 модул дар шабакаи протеоми майна, ки мо дарёфтем, дар шабакаи транскриптомӣ ҷойгиранд. Ҳатто дар кашф ва нусхабардории 34 модули сафедаи мо, ки дар протеомаи майна хеле нигоҳ дошта мешаванд, танҳо 14 (~ 40%) аз санҷиши дақиқи Фишер (FET) гузаштанд, ки бо транскриптом аз ҷиҳати оморӣ аҳамияти калон доранд (Расми 3A). Бо барқарорсозии зарари ДНК (P-M25 ва P-M19), тарҷумаи сафедаҳо (P-M7 ва P-M20), пайвастшавӣ/пайванди РНК (P-M16 ва P-M21) ва ҳадафгирии сафеда (P-M13 ва P- M23) бо модулҳои транскриптомӣ мувофиқат намекунад. Аз ин рӯ, гарчанде ки маҷмӯи маълумоти амиқтари протеом дар таҳлили такрории ҷорӣ истифода мешавад (13), аксарияти протеоми шабакаи AD ба шабакаи транскриптомӣ харита карда нашудааст.
(A) FET гипергеометрӣ ғанисозии аломатҳои мушаххаси навъи ҳуҷайраро дар модули РНК транскриптомии AD (боло) ва дараҷаи такрори байни модулҳои РНК (x-меҳвар) ва сафеда (y-меҳвар)-и мағзи сари AD-ро нишон медиҳад. (поён). Шиддати сояҳои сурх дараҷаи ғанисозии намудҳои ҳуҷайраҳо дар панели боло ва шиддатнокии такрори модулҳо дар панели поёнро нишон медиҳад. Ситорачаҳо аҳамияти оморӣ доранд (Р <0,05). $B) Дараљаи таносуби байни генњои хоси њар як модули транскриптомї ва њолати AD. Модулҳои чап бо AD (кабуд) ва модулҳои дар тарафи рост бо AD (сурх) иртибототи бештар мусбат доранд. Қимати P-и бо лог табдилёфтаи BH ислоҳшуда дараҷаи аҳамияти омории ҳар як таносубро нишон медиҳад. (C) Модулҳои такрории назаррас бо ғанисозии навъи ҳуҷайраҳои муштарак. (D) Таҳлили коррелятсияи тағирёбии қабати log2-и сафедаи нишонгузорӣ (х-меҳвар) ва РНК (y-меҳвар) дар модули такрорӣ. Коэффисиенти коррелятсияи Пирсон бо арзиши мувофиқи P нишон дода мешавад. Микро, микроглия; чисмхои осмонй, астроситхо. КТ, назорат.
Аксари модулҳои сафеда ва РНК ба ҳам мепайвандад профилҳои ғанисозии навъи ҳуҷайра ва самтҳои пайвастаи тағирёбии AD-ро мубодила мекунанд (Расми 3, B ва C). Ба ибораи дигар, модули M1-и протеомаи мағзи сар (PM1) ба се модули гомологии РНК аз нейронҳо (R-M1, R-M9 ва R-M16), ки дар AD ҳастанд, харита шудааст. сатҳи паст. Ба ҳамин монанд, модулҳои сафедаи аз глиалӣ бой M5 ва M18 бо модулҳои РНК бой аз астроситҳо ва маркерҳои микроглиалӣ (R-M3, R-M7 ва R-M10) мувофиқат мекунанд ва дар афзоиши бемориҳо хеле иштирок мекунанд. Ин хусусиятҳои модулии муштарак байни ду маҷмӯи додаҳо минбаъд ғанисозии навъи ҳуҷайра ва тағиротҳои марбут ба бемориро, ки мо дар протеомаи майна мушоҳида кардем, дастгирӣ мекунанд. Бо вуҷуди ин, мо фарқиятҳои зиёди назаррасро байни сатҳи РНК ва сафедаи маркерҳои инфиродӣ дар ин модулҳои муштарак мушоҳида кардем. Таҳлили коррелятсионии ифодаи дифференсиалии протеомика ва транскриптомияи молекулаҳо дар дохили ин модулҳои такроршаванда (Расми 3D) ин номувофиқатиро таъкид мекунад. Масалан, APP ва якчанд сафедаҳои дигари модули глиалӣ (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 ва SFRP1) афзоиши назарраси протеомаи AD-ро нишон доданд, аммо дар транскриптомаи AD қариб ҳеҷ гуна тағирот ба назар намерасид. Ин таѓйироти хоси сафедањо метавонанд бо лавњањои амилоидї зич алоќаманд бошанд (23, 35), ки протеомро њамчун манбаи таѓйироти патологї нишон медињанд ва ин таѓйиротњо дар транскриптом инъикос намешаванд.
Пас аз таҳлили мустақилонаи мағзи сар ва протеомҳои CSF, ки мо кашф кардем, мо таҳлили ҳамаҷонибаи ду маҷмӯи маълумотро барои муайян кардани биомаркерҳои AD CSF марбут ба патофизиологияи шабакаи мағзи сар гузаронидем. Мо аввал бояд ҳамбастагии ду протеомаро муайян кунем. Гарчанде ки ба таври васеъ эътироф карда мешавад, ки CSF тағироти нейрохимиявии майнаи AD-ро инъикос мекунад (4), дараҷаи дақиқи такрори мағзи сар ва протеомаи CSF норавшан аст. Бо муқоисаи шумораи маҳсулоти генҳои муштарак, ки дар ду протеомаи мо ошкор шудаанд, мо дарёфтем, ки тақрибан 70% (n = 1936) сафедаҳои дар моеъи мағзи сар муайяншуда низ дар мағзи сар муайян карда шудаанд (Расми 4А). Аксари ин сафедаҳои такроршаванда (n = 1721) ба яке аз 44 модули муштарак аз маҷмӯи маълумотҳои кашфи мағзи сар харита шудаанд (Расми 4B). Тавре интизор мерафт, шаш модули калонтарини мағзи сар (M1 то M6) миқдори зиёди такрори CSF-ро нишон доданд. Бо вуҷуди ин, модулҳои хурдтари майна мавҷуданд (масалан, M15 ва M29), ки дараҷаи ғайричашмдошти баландро ба даст меоранд, ки аз модули майна ду маротиба калонтар аст. Ин моро водор мекунад, ки усули муфассалтар ва оморӣ асосёфтаро барои ҳисоб кардани такрори байни майна ва моеъи мағзи сар истифода барем.
(A ва B) Сафедаҳое, ки дар мағзи кашф ва маҷмӯаҳои маълумоти CSF ошкор шудаанд, ба ҳам меоянд. Аксарияти ин сафедаҳои такроршаванда бо яке аз 44 модули муштараки шабакаи муштараки ифодаи майна алоқаманданд. (C) Пайдо кардани такрори байни протеомаи моеъи мағзи сар ва протеомаи шабакаи мағзи сар. Ҳар як сатри харитаи гармӣ таҳлили алоҳидаи такрории FET-и гипергеометриро нишон медиҳад. Дар сатри боло такрори (сояҳои хокистарӣ/сиёҳ) байни модули майна ва тамоми протеоми CSF тасвир шудааст. Сатри дуюм нишон медиҳад, ки такрори байни модулҳои мағзи сар ва сафедаи CSF (соя бо сурх) дар AD ба таври назаррас танзим карда мешавад (P <0.05). Сатри сеюм нишон медиҳад, ки такрори байни модулҳои майна ва сафедаи CSF (сояҳои кабуд) дар AD ба таври назаррас танзим карда мешавад (P <0.05). Усули BH-ро барои ислоҳ кардани арзиши P, ки аз FET гирифта шудааст, истифода баред. (D) Панели қабати модул дар асоси ассотсиатсияи навъи ҳуҷайра ва шартҳои марбут ба GO. Ин панелҳо дар маҷмӯъ 271 протеинҳои марбут ба мағзи сар доранд, ки дар протеомаи CSF ифодаи дифференсиалӣ доранд.
Бо истифода аз FET-ҳои яктарафа, мо аҳамияти такрори протеинро байни протеоми CSF ва модулҳои инфиродии майна арзёбӣ кардем. Таҳлил нишон дод, ки ҳамагӣ 14 модули мағзи сар дар маҷмӯи маълумоти CSF такрори аз ҷиҳати оморӣ муҳим доранд (FDR тасҳеҳи P <0,05) ва модули иловагӣ (M18), ки такрори он ба аҳамият наздик аст (FDR тасҳеҳшуда P = 0,06) (Расми 4C) , сатри боло). Мо инчунин ба модулҳое таваҷҷӯҳ дорем, ки бо сафедаҳои дифференсиалӣ ифодашудаи CSF сахт мувофиқат мекунанд. Аз ин рӯ, мо ду таҳлили иловагии FET-ро барои муайян кардани кадоме аз (i) протеини CSF дар AD ба таври назаррас афзоиш додем ва (ii) протеини CSF дар AD ба таври назаррас коҳиш ёфт (P <0,05, ҷуфтшуда t санҷиши AD/control) Модулҳои майна бо такрори пурмазмун байни онхо. Тавре ки дар сатрҳои миёна ва поёни расми 4C нишон дода шудааст, ин таҳлилҳои иловагӣ нишон медиҳанд, ки 8 аз 44 модули мағзи сар бо сафедаи дар AD CSF иловашуда (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 ва M38) ба таври назаррас мувофиқат мекунанд. . ), дар ҳоле ки танҳо ду модул (M6 ва M15) бо сафедаи камшуда дар AD CSF такрори пурмазмун нишон доданд. Тавре ки интизор мерафт, ҳамаи 10 модул дар 15 модул ҷойгиранд, ки бо протеоми CSF баландтарин мувофиқат доранд. Аз ин рӯ, мо тахмин мезанем, ки ин 15 модул манбаи ҳосили баланди биомаркерҳои CSF аз AD мебошанд.
Мо ин 15 модули якхеларо дар асоси наздикии онҳо дар диаграммаи дарахти WGCNA ва робитаи онҳо бо намудҳои ҳуҷайра ва онтологияи генҳо ба панҷ панели калони сафеда ҷамъ кардем (Расми 4D). Дар панели аввал дорои модулҳои бой аз маркерҳои нейрон ва сафедаҳои марбут ба синапс (M1 ва M12). Панели синаптикӣ дар маҷмӯъ 94 сафеда дорад ва сатҳҳо дар протеомаи CSF ба таври назаррас тағйир ёфта, онро дар байни панҷ панел бузургтарин манбаи аломатҳои CSF марбут ба майна табдил медиҳанд. Гурӯҳи дуюм (M6 ва M15) робитаи зичро бо маркерҳои ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ ва бадани рагҳо, аз қабили "табобати захмҳо" (M6) ва "танзими аксуламали иммунии гуморалӣ" (M15) нишон доданд. M15 инчунин бо мубодилаи липопротеинҳо, ки бо эндотелий зич алоқаманд аст, алоқаманд аст (36). Панели рагҳо дорои 34 аломатҳои CSF-и марбут ба майна мебошад. Ба гурӯҳи сеюм модулҳо (M2 ва M4) дохил мешаванд, ки ба таври назаррас ба аломатҳои олигодендроситҳо ва паҳншавии ҳуҷайраҳо алоқаманданд. Масалан, истилоҳҳои онтологии сатҳи болоии M2 "танзими мусбати репликатсияи ДНК" ва "раванди биосинтези пурин" -ро дар бар мегиранд. Дар ҳамин ҳол, онҳо аз M4 иборатанд аз "фарқкунии ҳуҷайраҳои глиалӣ" ва "сегрегатсияи хромосомаҳо". Панели миелинатсия дорои 49 аломатҳои CSF-и марбут ба майна мебошад.
Гурӯҳи чорум модулҳои бештарро дар бар мегирад (M30, M29, M18, M24 ва M5) ва қариб ҳамаи модулҳо аз микроглия ва аломатҳои астроцитӣ хеле бой мебошанд. Монанди панели миелинатсия, панели чорум инчунин модулҳоро дар бар мегирад (M30, M29 ва M18), ки бо паҳншавии ҳуҷайраҳо зич алоқаманданд. Модулҳои дигари ин гурӯҳ ба истилоҳҳои иммунологӣ, аз қабили “раванди таъсири иммунӣ” (M5) ва “танзими аксуламали иммунӣ” (M24) алоқаманданд. Гурӯҳи иммунии глиалӣ дорои 42 аломатҳои CSF-и марбут ба майна мебошад. Ниҳоят, панели охирин 52 маркерҳои марбут ба мағзи сарро дар чор модул (M44, M3, M33 ва M38) дар бар мегирад, ки ҳамаи онҳо дар бадан вобаста ба нигоҳдории энергия ва мубодилаи моддаҳо мебошанд. Калонтарини ин модулҳо (M3) бо митохондрияҳо зич алоқаманданд ва аз маркерҳои хоси нейрон бой мебошанд. M38 яке аз аъзои хурдтари модул дар ин метаболом аст ва инчунин хусусияти мӯътадили нейронро нишон медиҳад.
Дар маҷмӯъ, ин панҷ панел доираи васеи намудҳо ва вазифаҳои ҳуҷайраҳоро дар кортекси AD инъикос мекунанд ва дар маҷмӯъ 271 аломатҳои CSF-и марбут ба мағзи сарро дар бар мегиранд (Ҷадвали S2G). Барои арзёбии дурустии ин натиҷаҳои MS, мо таҳлили васеъшавии наздикиро (PEA), технологияи ортогоналӣ дар асоси антитело бо қобилиятҳои мултиплексӣ, ҳассосият ва хосияти баландро истифода бурдем ва намунаҳои моеъи мағзи сарро аз нав таҳлил кардем, ки зер маҷмӯи ин 271 биомаркерро пайдо кардем. (n = 36). Ин 36 ҳадаф тағиротро дар AD сершумори PEA нишон медиҳанд, ки бо бозёфтҳои MS дар асоси мо (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) зич алоқаманд аст, ки натиҷаҳои таҳлили ҳамаҷонибаи MS-и моро сахт тасдиқ карданд (Расми S4) ).
Мавзӯҳои биологие, ки панҷ гурӯҳи мо таъкид кардаанд, аз сигнализатсияи синаптикӣ то мубодилаи энергия, ҳама ба патогенези AD алоқаманданд (1-3). Аз ин рӯ, ҳама 15 модули дорои ин панелҳо ба патологияи AD дар протеомаи мағзи сар, ки мо кашф кардем, алоқаманданд (Расми 2B). Муҳимтар аз ҳама таносуби баланди мусбати патологӣ байни модулҳои глиалии мо ва таносуби қавии манфии патологӣ байни бузургтарин модулҳои нейроналии мо (M1 ва M3) мебошад. Таҳлили экспрессияи дифференсиалии протеоми такроршудаи майнаи мо (Расми S3D) инчунин сафедаҳои глиалии аз M5 ва M18 гирифташударо таъкид мекунад. Дар AsymAD ва симптоматикии AD, зиёдшавии сафедаҳои глиалӣ ва синапсҳои марбут ба M1. Протеин аз ҳама бештар кам мешавад. Ин мушоҳидаҳо нишон медиҳанд, ки 271 аломатҳои моеъи мағзи сар, ки мо дар панҷ гурӯҳ муайян кардем, ба равандҳои бемориҳо дар кортекси AD, аз ҷумла онҳое, ки дар марҳилаҳои ибтидоии асимптоматикӣ рух медиҳанд, алоқаманданд.
Барои беҳтар таҳлил кардани самти тағирёбии сафедаҳои панел дар майна ва моеъи ҳароммағз, мо барои ҳар як аз 15 модули ба ҳам мувофиқ омада чунинҳоро кашем: (i) сатҳи фаровонии модулро дар маҷмӯи маълумоти майна ва (ii) модул сафеда Фарқият дар моеъи мағзи сар ифода меёбад (расми S5). Тавре ки қаблан зикр гардид, WGCNA барои муайян кардани фаровонии модул ё арзиши хоси сафеда дар майна истифода мешавад (13). Харитаи вулқон барои тавсифи ифодаи дифференсиалии сафедаҳои модулӣ дар моеъи мағзи сар (AD/control) истифода мешавад. Ин рақамҳо нишон медиҳанд, ки се аз панҷ панел тамоюлҳои гуногуни ифодаро дар майна ва моеъи ҳароммағз нишон медиҳанд. Ду модули панели синапс (M1 ва M12) коҳиши сатҳи фаровониро дар мағзи AD нишон медиҳанд, аммо ба таври назаррас бо протеини зиёд дар AD CSF мувофиқат мекунанд (Расми S5A). Модулҳои марбут ба нейрон, ки дорои метаболом мебошанд (M3 ва M38) намунаҳои шабеҳи ифодаи майна ва моеъи мағзи сарро нишон доданд (Расми S5E). Панели рагҳо инчунин тамоюлҳои гуногуни ифодаро нишон дод, гарчанде ки модулҳои он (M6 ва M15) дар майнаи AD ба таври мӯътадил зиёд шуда буданд ва дар CSF бемор коҳиш ёфтанд (Расми S5B). Ду панели боқимонда дорои шабакаҳои калони глиалӣ мебошанд, ки сафедаҳои онҳо дар ҳарду қисм пайваста танзим карда мешаванд (Тасвири S5, C ва D).
Лутфан таваҷҷӯҳ намоед, ки ин тамоюлҳо барои ҳама нишонгузорҳои ин панелҳо умумӣ нестанд. Масалан, панели синаптикӣ якчанд сафедаҳоро дар бар мегирад, ки дар мағзи сар ва CSF ба таври назаррас коҳиш меёбанд (Расми S5A). Дар байни ин аломатҳои моеъи мағзи сар аз танзимшавандаи NPTX2 ва VGF аз M1 ва хромогранини В аз M12 мебошанд. Аммо, сарфи назар аз ин истисноҳо, аксари аломатҳои синаптикии мо дар моеъи сутунмӯҳраи AD баланд мешаванд. Умуман, ин таҳлилҳо тавонистанд тамоюлҳои аз ҷиҳати оморӣ муҳимро дар сатҳи майна ва моеъи мағзи сар дар ҳар як панҷ панели мо фарқ кунанд. Ин тамоюлҳо муносибати мураккаб ва аксаран гуногунро байни мағзи сар ва протеини CSF дар AD таъкид мекунанд.
Сипас, мо таҳлили баландсуръати репликатсияи MS-ро (репликатсияи CSF 1) истифода бурдем, то 271 маҷмӯи биомаркерҳои худро ба ҳадафҳои умедбахш ва такроршаванда маҳдуд созем (Расми 5А). Нусхаи CSF 1 ҳамагӣ 96 намунаро аз Emory Goizueta ADRC, аз ҷумла назорат, AsymAD ва гурӯҳи AD (Ҷадвали S1A) дар бар мегирад. Ин ҳолатҳои AD бо коҳиши сабуки маърифатӣ (ба ҳисоби миёна MoCA, 20.0 ± 3.8) ва тағирот дар биомаркерҳои AD дар моеъи мағзи сар тасдиқ карда мешаванд (Ҷадвали S1A). Бар хилофи таҳлили CSF, ки мо дарёфтем, ин такрорӣ бо истифода аз усули муассиртар ва баландсуръати "як зарбаи" MS (бидуни фраксияи оф-лайн), аз ҷумла протоколи соддакардашудаи омодасозии намуна, ки зарурати норасоии масунияти намунаҳои алоҳидаро аз байн мебарад, анҷом дода мешавад. . Ба ҷои ин, як "канали такмилдиҳии" аз иммунитет камшуда барои тақвият додани сигнали сафедаҳои камтар фаровон истифода мешавад (37). Гарчанде ки он фарогирии умумии протеомро коҳиш медиҳад, ин усули яккарата вақти мошинро ба таври назаррас коҳиш медиҳад ва шумораи намунаҳои бо нишони TMT-ро, ки қобили таҳлил мешаванд, зиёд мекунад (17, 38). Дар маҷмӯъ, таҳлил 6,487 пептидҳоро муайян кард, ки дар 96 ҳолат ба 1,183 протеомҳо оварда шудаанд. Тавре ки ҳангоми таҳлили CSF мо дарёфтем, танҳо он сафедаҳое, ки дар ҳадди аққал 50% намунаҳо миқдорашон муайян карда шудаанд, ба ҳисобҳои минбаъда дохил карда шуданд ва маълумотҳо барои таъсири синну сол ва ҷинс регресс карда шуданд. Ин ба миқдори ниҳоии 792 протеома оварда расонд, ки 95% онҳо инчунин дар маҷмӯи маълумоти CSF пайдо шудаанд.
(A) Ҳадафҳои протеини CSF, ки бо майна алоқаманданд, дар когорти аввалини CSF тасдиқ карда шудаанд ва ба панели ниҳоӣ дохил карда шудаанд (n = 60). (B то E) Сатҳи биомаркери панел (холҳои таркибии z) дар чор гурӯҳи такрории CSF чен карда шудаанд. Барои арзёбии аҳамияти омории тағирот дар фаровонӣ дар ҳар як таҳлили такрорӣ t-санҷишҳои ҷуфтшуда ё ANOVA бо ислоҳи пас аз Tukey истифода шуданд. КТ, назорат.
Азбаски мо махсусан ба тафтиши 271 ҳадафи CSF-и марбут ба мағзи сар тавассути таҳлили ҳамаҷониба таваҷҷӯҳ дорем, мо санҷиши минбаъдаи ин протеомаи такроршавандаро бо ин маркерҳо маҳдуд хоҳем кард. Дар байни ин 271 сафеда, 100-тоаш дар репликатсияи CSF 1 ошкор карда шуданд. Тасвири S6A ифодаи дифференсиалии ин 100 аломати такроршавандаро байни намунаҳои репликатсияи назоратӣ ва AD нишон медиҳад. Гистонҳои синаптикӣ ва метаболитӣ дар AD бештар афзоиш меёбанд, дар ҳоле ки сафедаҳои рагҳо дар беморӣ бештар кам мешаванд. Аксари 100 аломатҳои такроршаванда (n = 70) як самти тағиротро дар ду маҷмӯи додаҳо нигоҳ медоштанд (Расми S6B). Ин 70 маркерҳои тасдиқшудаи CSF марбут ба мағзи сар (Ҷадвали S2H) асосан тамоюлҳои ифодаи панели қаблан мушоҳидашударо инъикос мекунанд, яъне танзими пасти сафедаҳои рагҳо ва танзими болоии ҳама панелҳои дигар. Танҳо 10-тои ин 70 сафедаи тасдиқшуда тағиротро дар фаровонии AD нишон доданд, ки ба ин тамоюлҳои панел мухолифанд. Барои тавлиди панеле, ки тамоюли умумии майна ва моеъи мағзи сарро беҳтар инъикос мекунад, мо ин 10 сафедаро аз панели таваҷҷӯҳе, ки дар ниҳоят тасдиқ кардем, хориҷ кардем (Расми 5А). Аз ин рӯ, панели мо дар ниҳояти кор 60 протеинро дар бар мегирад, ки дар ду гурӯҳи мустақили CSF AD бо истифода аз омодасозии намунаҳои гуногун ва таҳлили платформаи MS санҷида шудаанд. Қитъаҳои ифодаи z-холҳои ин панелҳои ниҳоӣ дар CSF нусхаи назорати 1 ва ҳолатҳои AD тамоюли панелро дар когорти CSF, ки мо ёфтаем, тасдиқ карданд (Расми 5B).
Дар байни ин 60 сафеда, молекулаҳое мавҷуданд, ки бо AD алоқаманданд, ба монанди остеопонтин (SPP1), ки як ситокини зидди илтиҳобист, ки дар бисёр тадқиқотҳо бо AD алоқаманд аст (39-41) ва GAP43, протеини синаптикӣ. ки ба таври возеҳ ба нейродегенератсия алоқаманд аст (42). Протеинҳои аз ҳама пурра санҷидашуда маркерҳои марбут ба дигар бемориҳои нейродегенеративӣ мебошанд, ба монанди склерози паҳлӯии амиотрофӣ (ALS) вобаста ба супероксиди дисмутаза 1 (SOD1) ва десахаразаи бемории Паркинсон (PARK7) . Мо инчунин тасдиқ кардем, ки бисёр аломатҳои дигар, аз қабили SMOC1 ва протеини 1 (BASP1) пайвасти мембранаи бойи мағзи сар, робитаҳои қаблиро ба нейродегенератсия маҳдуд кардаанд. Қобили зикр аст, ки аз сабаби кам будани миқдори умумии онҳо дар протеомаи CSF, барои мо истифодаи ин усули баландсуръати муайянкунии як зарба барои боэътимод муайян кардани MAPT ва баъзе дигар сафедаҳои марбут ба AD (масалан, NEFL ва NRGN) душвор аст. ) (43, 44).
Пас аз он мо ин 60 аломати афзалиятноки панелро дар се таҳлили иловагии такрорӣ тафтиш кардем. Дар CSF Copy 2, мо як TMT-MS-ро барои таҳлили як гурӯҳи мустақили 297 намунаи назорат ва AD аз Эмори Гоизуета ADRC (17) истифода бурдем. Репликатсияи CSF 3 таҳлили дубораи маълумоти дастраси TMT-MS аз 120 беморони назоратӣ ва AD аз Лозанна, Швейтсарияро дар бар гирифт (45). Мо дар ҳар як маҷмӯаи маълумот зиёда аз се ду ҳиссаи 60 аломати афзалиятнокро муайян кардем. Гарчанде ки тадқиқоти Швейтсария платформаҳои гуногуни MS ва усулҳои миқдорӣ TMT-ро истифода бурд (45, 46), мо тамоюлҳои панели худро дар ду таҳлили такрорӣ (Расми 5, C ва D ва Ҷадвалҳои S2, I ва J) сахт таҷдид кардем. Барои арзёбии хосияти бемории гурӯҳи мо, мо TMT-MS-ро барои таҳлили маҷмӯи маълумоти такрории чорум (репликатсияи CSF 4) истифода бурдем, ки на танҳо ҳолатҳои назоратӣ (n = 18) ва AD (n = 17), балки инчунин PD (n = 17) -ро дар бар мегирад. Намунаҳои n = 14)), ALS (n = 18) ва деменцияи фронтотумпоралӣ (FTD) (n = 11) (Ҷадвали S1A). Мо тақрибан аз се ду ҳиссаи сафедаҳои панелро дар ин когорт бомуваффақият муайян кардем (38 аз 60). Ин натиҷаҳо тағйироти хоси AD-ро дар ҳама панҷ панели биомаркер нишон медиҳанд (Расми 5E ва Ҷадвали S2K). Афзоиши гурӯҳи метаболитҳо қавитарин хосияти AD, пас аз он гурӯҳи миелинизатсия ва глиалиро нишон дод. Ба андозаи камтар, FTD инчунин афзоиши байни ин панелҳоро нишон медиҳад, ки метавонад тағироти шабеҳи эҳтимолии шабакаро инъикос кунад (17). Баръакси ин, ALS ва PD тақрибан ҳамон профилҳои миелинизатсия, глиал ва метаболомро ҳамчун гурӯҳи назоратӣ нишон доданд. Дар маҷмӯъ, сарфи назар аз фарқиятҳо дар тайёр кардани намуна, платформаи MS ва усулҳои миқдорӣ TMT, ин таҳлилҳои такрорӣ нишон медиҳанд, ки аломатҳои панели афзалиятноки мо дар зиёда аз 500 намунаҳои беназири CSF тағйироти хеле пайвастаи мушаххаси AD доранд.
Нейродегенератсияи AD чанд сол пеш аз фарорасии нишонаҳои маърифатӣ ба таври васеъ эътироф шудааст, аз ин рӯ ниёзи фаврӣ ба биомаркерҳои AsymAD вуҷуд дорад (5, 31). Бо вуҷуди ин, далелҳои бештар ва бештар нишон медиҳанд, ки биологияи AsymAD аз якхела нест ва ҳамкории мураккаби хатар ва устуворӣ ба фарқиятҳои калони инфиродӣ дар пешрафти минбаъдаи беморӣ оварда мерасонад (47). Гарчанде ки барои муайян кардани ҳолатҳои AsymAD истифода мешавад, сатҳҳои биомаркерҳои асосии CSF (Aβ1-42, total tau ва p-tau) исбот накардаанд, ки қодир ба пешгӯии боэътимоди кӣ ба деменсия пешравӣ мекунад (4, 7), ки ин метавонад бештар бошад. зарур аст, ки асбобҳои биомаркерии ҳамаҷониба дар асоси ҷанбаҳои сершумори физиологияи мағзи сар барои ба таври дақиқ тақсим кардани хатари ин аҳолӣ. Аз ин рӯ, мо баъдан панели биомаркери аз ҷониби AD тасдиқшудаи худро дар популятсияи AsymAD нусхаи CSF 1 таҳлил кардем. Ин 31 ҳолати AsymAD сатҳҳои ғайримуқаррарии биомаркерро (Aβ1–42/таносуби умумии ELISA, <5,5) ва шинохти комилро (ба ҳисоби миёна MoCA, 27,1) нишон доданд. ± 2.2) (Ҷадвали S1A). Илова бар ин, ҳамаи ашхоси дорои AsymAD дорои холҳои клиникии дементияи 0 мебошанд, ки нишон медиҳад, ки ҳеҷ далели коҳиши фаъолияти ҳаррӯзаи маърифатӣ ё функсионалӣ вуҷуд надорад.
Мо аввал сатҳҳои панелҳои тасдиқшударо дар ҳама 96 нусхаи CSF 1, аз ҷумла когорти AsymAD таҳлил кардем. Мо дарёфтем, ки якчанд панелҳо дар гурӯҳи AsymAD тағйироти назарраси фаровонии AD доранд, панели рагҳо дар AsymAD тамоюли коҳишро нишон дод, дар ҳоле ки ҳамаи панелҳои дигар тамоюли болоро нишон доданд (Расми 6A). Аз ин рӯ, ҳама панелҳо бо ELISA Aβ1-42 ва сатҳи умумии tau таносуби хеле муҳимро нишон доданд (Расми 6B). Баръакси ин, таносуби байни гурӯҳ ва холҳои MoCA нисбатан заиф аст. Яке аз бозёфтҳои ҷолибтар аз ин таҳлилҳо доираи васеи фаровонии панелҳо дар гурӯҳи AsymAD мебошад. Тавре ки дар расми 6А нишон дода шудааст, сатҳи панели гурӯҳи AsymAD одатан аз сатҳи панели гурӯҳи назоратӣ ва гурӯҳи AD убур карда, тағйирёбии нисбатан баландро нишон медиҳад. Барои боз ҳам омӯхтани ин гетерогении AsymAD, мо таҳлили миқёси бисёрченакаро (MDS) ба 96 ҳолати такрории CSF 1 татбиқ кардем. Таҳлили MDS имкон медиҳад, ки шабоҳати байни парвандаҳо дар асоси тағирёбандаҳои муайяни маҷмӯи додаҳо тасаввур карда шавад. Барои ин таҳлили кластер, мо танҳо он маркерҳои панели тасдиқшударо истифода мебарем, ки дар сатҳи кашфи CSF ва репликатсияи протеоми 1 (n = 29) (Ҷадвали S2L) тағироти аз ҷиҳати оморӣ муҳим доранд (P <0,05, AD/control). Ин таҳлил дар байни назорати мо ва ҳолатҳои AD кластерҳои равшани фазоиро ба вуҷуд овард (Расми 6C). Баръакси ин, баъзе ҳолатҳои AsymAD дар гурӯҳи назоратӣ ба таври равшан гурӯҳбандӣ шудаанд, дар ҳоле ки дигарон дар ҳолатҳои AD ҷойгиранд. Барои боз ҳам омӯхтани ин гетерогении AsymAD, мо харитаи MDS-и худро барои муайян кардани ду гурӯҳи ин парвандаҳои AsymAD истифода кардем. Ба гурӯҳи аввал ҳолатҳои AsymAD дохил карда шуданд, ки ба назорат наздиктаранд (n = 19), дар ҳоле ки гурӯҳи дуюм бо ҳолатҳои AsymAD бо профили маркерӣ ба AD наздиктар тавсиф карда шуданд (n = 12).
(A) Сатҳи ифодаи (z-хол) гурӯҳи биомаркери CSF дар ҳама 96 намуна дар когорти репликатсияи CSF 1, аз ҷумла AsymAD. Барои арзёбии аҳамияти омории тағйироти фаровонии панел, таҳлили ихтилоф бо ислоҳи пас аз Тукей истифода шудааст. (B) Таҳлили таносуби сатҳи фаровонии сафедаи панел (z-хол) бо холҳои MoCA ва сатҳи умумии tau дар ELISA Aβ1-42 ва CSF нусхаи 1. Коэффисиенти коррелятсияи Пирсон бо арзиши мувофиқи P нишон дода мешавад. (C) MDS-и 96 парвандаи нусхаи CSF 1 ба сатҳи фаровонии 29 нишонгузори тасдиқшудаи панел асос ёфтааст, ки онҳо ҳам дар кашф ва ҳам дар маҷмӯи маълумотҳои нусхаи CSF 1 ба таври назаррас тағйир ёфтанд [P <0.05 AD/control (CT)]. Ин таҳлил барои тақсим кардани гурӯҳи AsymAD ба зергурӯҳҳои назоратӣ (n = 19) ва AD (n = 12) истифода шудааст. (D) Сюжети вулқон ифодаи дифференсиалии ҳамаи сафедаҳои репликатсияи CSF 1-ро бо тағирёбии қабати log2 (x-меҳвар) нисбат ба арзиши омории P -log10 байни ду зергурӯҳи AsymAD нишон медиҳад. Биомакерҳои панел рангаанд. (E) Репликатсияи CSF 1 Сатҳи фаровонии биомаркерҳои гурӯҳи интихобӣ байни зергурӯҳҳои AsymAD ба таври дифференсиалӣ ифода карда мешаванд. Барои арзёбии аҳамияти оморӣ таҳлили пас аз ислоҳшудаи дисперсия аз ҷониби Тукей истифода шудааст.
Мо ифодаи дифференсиалии протеинро байни ин назорат ва ҳолатҳои ба AD монанд AsymAD тафтиш кардем (Тасвири 6D ва Ҷадвали S2L). Харитаи вулқон дар натиҷа нишон медиҳад, ки 14 аломати панел дар байни ду гурӯҳ ба таври назаррас тағйир ёфтааст. Аксарияти ин маркерҳо аъзои синапс ва метаболома мебошанд. Аммо, SOD1 ва субстрати сафедаи киназа C (MARCKS), ки мутаносибан аъзои гурӯҳҳои иммунии миелин ва глиалӣ мебошанд, инчунин ба ин гурӯҳ тааллуқ доранд (Расми 6, D ва E). Панели рагҳо инчунин ду маркерро, ки дар гурӯҳи ба монанди AD AsymAD ба таври назаррас коҳиш ёфтанд, саҳм гузоштанд, аз ҷумла протеини ҳатмии AE 1 (AEBP1) ва узви оилаи C9. Дар ELISA AB1-42 (P = 0.38) ва p-tau (P = 0.28) байни зергурӯҳҳои назорат ва ба монанди AD AsymAD фарқияти назаррас вуҷуд надошт, аммо дар ҳақиқат дар сатҳи умумии tau (P = 0.0031) фарқияти назаррас вуҷуд дошт. ) (расми S7). Якчанд аломатҳои панел мавҷуданд, ки нишон медиҳанд, ки тағирот байни ду зергурӯҳи AsymAD аз сатҳи умумии tau (масалан, YWHAZ, SOD1 ва MDH1) муҳимтар аст (Расми 6E). Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки панели тасдиқшудаи мо метавонад биомаркерҳоро дар бар гирад, ки метавонанд зергурӯҳҳо ва табақабандии эҳтимолии хатари беморони гирифтори бемории асимптоматикӣ дошта бошанд.
Зарурати фаврӣ ба абзорҳои биомаркерҳои системавӣ барои беҳтар андозагирӣ ва ҳадафи патофизиологияи мухталифи паси AD вуҷуд дорад. Интизор меравад, ки ин воситаҳо на танҳо чаҳорчӯбаи ташхиси AD-и моро тағир диҳанд, балки ба қабули стратегияҳои муассир ва мушаххаси табобати беморон мусоидат кунанд (1, 2). Бо ин мақсад, мо як равиши беғаразонаи ҳамаҷонибаи протеомикаро ба мағзи сар ва CSF барои муайян кардани биомаркерҳои CSF дар асоси веб истифода бурдем, ки доираи васеи патофизиологияи мағзи сарро инъикос мекунанд. Таҳлили мо панҷ панели биомаркери CSF истеҳсол кард, ки (i) синапсҳо, рагҳои хунгузар, миелин, дисфунксияи иммунӣ ва метаболикиро инъикос мекунанд; (ii) дар платформаҳои гуногуни MS такроршавандагии қавӣ нишон диҳед; (iii) Тағироти прогрессивии хоси бемориро дар марҳилаҳои ибтидоӣ ва охири AD нишон диҳед. Дар маҷмӯъ, ин бозёфтҳо як қадами умедбахш дар самти таҳияи абзорҳои биомаркерҳои гуногун, боэътимод ва ба веб нигаронидашуда барои таҳқиқоти AD ва барномаҳои клиникӣ мебошанд.
Натиҷаҳои мо ташкили хеле ҳифзшудаи протеоми шабакаи мағзи сарро нишон медиҳанд ва истифодаи онро ҳамчун лангар барои рушди биомаркер дар асоси система дастгирӣ мекунанд. Таҳлили мо нишон медиҳад, ки ду маҷмӯи додаҳои мустақили TMT-MS, ки дорои мағзи сарҳои AD ва AsymAD мебошанд, модулияти қавӣ доранд. Ин бозёфтҳо кори қаблии моро васеъ намуда, нигоҳдории модулҳои пурқудрати зиёда аз 2000 бофтаҳои майнаро аз гурӯҳҳои мустақили сершумор дар кортекси фронталӣ, париеталӣ ва муваққатӣ нишон медиҳанд (17). Ин шабакаи консенсус тағироти мухталифи марбут ба бемориҳоро, ки дар таҳқиқоти ҷорӣ мушоҳида шудааст, инъикос мекунад, аз ҷумла афзоиши модулҳои илтиҳобии аз глиалӣ бой ва коҳиши модулҳои бойи нейрон. Мисли тадқиқоти ҷорӣ, ин шабакаи васеъмиқёс инчунин тағйироти назарраси модулиро дар AsymAD дар бар мегирад, ки патофизиологияи гуногуни пеш аз клиникиро нишон медиҳад (17).
Бо вуҷуди ин, дар ин чаҳорчӯбаи хеле консервативии ба система асосёфта, гетерогении бештари биологӣ вуҷуд дорад, махсусан дар байни шахсони алоҳида дар марҳилаҳои аввали AD. Панели биомаркери мо қодир аст, ки ду зергурӯҳро дар AsymAD тасвир кунад, ки ифодаи фарқияти назарраси маркерҳои сершумори CSF-ро нишон медиҳанд. Гурӯҳи мо тавонист фарқиятҳои биологиро байни ин ду зергурӯҳ, ки дар сатҳи биомаркерҳои асосии AD равшан набуданд, нишон диҳад. Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, таносуби Aβ1-42 / умумии tau ин афроди AsymAD ба таври ғайримуқаррарӣ паст буданд. Аммо, танҳо сатҳи умумии tau байни ду зергурӯҳи AsymAD ба таври назаррас фарқ мекард, дар ҳоле ки сатҳҳои Aβ1-42 ва p-tau нисбатан муқоисашаванда боқӣ монданд. Азбаски tau баланди CSF нисбат ба сатҳҳои Aβ1-42 (7) пешгӯии беҳтари нишонаҳои маърифатӣ ба назар мерасад, мо гумон мекунем, ки ду гурӯҳи AsymAD метавонанд хатарҳои гуногуни пешрафти беморӣ дошта бошанд. Бо назардошти андозаи маҳдуди намунаи AsymAD-и мо ва набудани маълумоти тӯлонӣ, барои ба таври эътимодбахш баровардани ин хулосаҳо тадқиқоти минбаъда лозим аст. Аммо, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки як панели CSF дар асоси система метавонад қобилияти моро барои ба таври муассир тақсим кардани шахсони алоҳида дар марҳилаи асимптоматикии беморӣ афзоиш диҳад.
Дар маҷмӯъ, бозёфтҳои мо нақши бисёр функсияҳои биологиро дар патогенези AD дастгирӣ мекунанд. Аммо, мубодилаи номунтазами энергетикӣ мавзӯи барҷастаи ҳамаи панҷ панели тамғагузории тасдиқшудаи мо гардид. Протеинҳои метаболикӣ, аз қабили гипоксантин-гуанин фосфорибосилтрансфераза 1 (HPRT1) ва лактатдегидрогеназа А (LDHA) биомаркерҳои боэътимоди тасдиқшудаи синаптикӣ мебошанд, ки нишон медиҳанд, ки афзоиши AD CSF ҷинси хеле такроршаванда аст. Рагҳои хун ва панелҳои глиалии мо инчунин дорои якчанд аломатҳое мебошанд, ки дар мубодилаи моддаҳои оксидкунанда иштирок мекунанд. Ин бозёфтҳо ба нақши калидӣ, ки равандҳои мубодилаи моддаҳо дар тамоми майна бозӣ мекунанд, на танҳо барои қонеъ кардани талаботи баланди энергияи нейронҳо, балки барои қонеъ кардани талаботи баланди энергияи астроситҳо ва дигар ҳуҷайраҳои глиалӣ мувофиқат мекунанд (17, 48). Натиҷаҳои мо далелҳои афзояндаро дастгирӣ мекунанд, ки тағирот дар потенсиали оксидшавӣ ва қатъи роҳҳои энергетикӣ метавонад пайванди асосии байни якчанд равандҳои калидӣ, ки дар патогенези AD, аз ҷумла ихтилоли митохондриалӣ, илтиҳоби глиалӣ ва осеби рагҳо мебошанд (49). Илова бар ин, биомаркерҳои метаболикии моеъи мағзи сар дорои миқдори зиёди протеинҳои аз ҷиҳати дифференсиалӣ бой байни назорати мо ва зергурӯҳҳои ба AD ба AsymAD монанд буда, аз он шаҳодат медиҳанд, ки вайроншавии ин роҳҳои энергетикӣ ва редокс дар марҳилаи пеш аз клиникии беморӣ муҳим аст.
Тамоюлҳои гуногуни панели майна ва моеъи мағзи сар, ки мо мушоҳида кардем, инчунин оқибатҳои ҷолиби биологӣ доранд. Синапсҳо ва метаболомҳои бой аз нейронҳо паст шудани сатҳи майнаи AD ва зиёд шудани фаровонии моеъи мағзи сарро нишон медиҳанд. Бо назардошти он, ки нейронҳо аз митохондрияҳои тавлидкунандаи энергия дар синапсҳо бой ҳастанд, то сигналҳои сершумори махсуси худро энергия таъмин кунанд (50), шабоҳати профилҳои ифодаи ин ду гурӯҳи нейронҳо дар назар аст. Аз даст додани нейронҳо ва экструзияи ҳуҷайраҳои вайроншуда метавонанд ин тамоюлҳои панели майна ва CSF-ро дар бемории дертар шарҳ диҳанд, аммо онҳо тағироти панели аввалиро, ки мо мушоҳида мекунем, шарҳ дода наметавонанд (13). Як шарҳи эҳтимолии ин бозёфтҳо дар бемории барвақти асимптоматик навдаро ғайримуқаррарии синаптикӣ мебошад. Далелҳои нав дар моделҳои муш нишон медиҳанд, ки фагоцитози синаптикии микроглия метавонад дар AD ба таври ғайримуқаррарӣ фаъол шавад ва боиси талафоти барвақти синапс дар майна гардад (51). Ин маводи синаптикии партофташуда метавонад дар CSF ҷамъ шавад, аз ин рӯ мо афзоиши CSF-ро дар панели нейрон мушоҳида мекунем. Буридани синаптикии тавассути иммунизатсияшуда инчунин метавонад қисман афзоиши сафедаҳои глиалиро, ки мо дар майна ва моеъи мағзи сар дар тамоми раванди беморӣ мушоҳида мекунем, шарҳ диҳад. Илова ба буридани синаптикӣ, нуқсонҳои умумӣ дар роҳи экзоситикӣ инчунин метавонанд ба ифодаҳои гуногуни майна ва CSF-и маркерҳои нейронӣ оварда расонанд. Як катор тадкикотхо нишон доданд, ки мазмуни экзосомахо дар патогенези майнаи АД тагйир ёфтааст (52). Роҳи берун аз ҳуҷайра инчунин дар паҳншавии Aβ иштирок мекунад (53, 54). Бояд қайд кард, ки фурўхтани секрецияи экзосомалӣ метавонад патологияи ба AD монандро дар моделҳои трансгении мушҳои AD коҳиш диҳад (55).
Дар айни замон, сафеда дар панели рагҳо афзоиши мӯътадили майнаи AD нишон дод, аммо дар CSF хеле кам шуд. Норасоии монеаи хун-мағзи сар (BBB) метавонад қисман ин бозёфтҳоро шарҳ диҳад. Бисёре аз таҳқиқоти мустақили пас аз марги инсон вайроншавии BBB-ро дар AD нишон доданд (56, 57). Ин тадқиқотҳо фаъолиятҳои гуногуни ғайримуқаррариро дар атрофи ин қабати маҳкам пӯшидаи ҳуҷайраҳои эндотелия, аз ҷумла ихроҷи капиллярҳои мағзи сар ва ҷамъшавии периваскулярии сафедаҳои хун тавассути хун тасдиқ карданд (57). Ин метавонад шарҳи оддии сафедаҳои рагҳои рагҳои мағзи сарро фароҳам оварад, аммо он камшавии ҳамин сафедаҳо дар моеъи ҳароммағзро пурра шарҳ дода наметавонад. Як эҳтимолият ин аст, ки системаи марказии асаб ин молекулаҳоро барои ҳалли мушкилоти зиёд шудани илтиҳоб ва фишори оксидитивӣ фаъолона ҷудо мекунад. Коҳиши баъзе аз сафедаҳои шадидтарини CSF дар ин панел, махсусан онҳое, ки дар танзими липопротеинҳо иштирок мекунанд, ба ҷилавгирӣ аз сатҳи зараровари илтиҳоб ва раванди нейропротектории намудҳои реактивии оксиген алоқаманд аст. Ин ба Пароксоназа 1 (PON1), як ферменти пайвасткунандаи липопротеинҳо, ки барои паст кардани сатҳи фишори оксидитивӣ дар гардиш масъул аст, дуруст аст (58, 59). Алфа-1-микроглобулин/бикунин прекурсори (AMBP) боз як аломати ба таври назаррас паст танзимшавандаи гурӯҳи рагҳо мебошад. Он пешгузаштаи интиқолдиҳандаи липидҳои бикунин мебошад, ки инчунин дар рафъи илтиҳоб ва муҳофизати неврологӣ иштирок мекунад (60, 61).
Сарфи назар аз фарзияҳои гуногуни ҷолиб, нотавонӣ барои мустақиман ошкор кардани механизмҳои бемориҳои биохимиявӣ як маҳдудияти маъруфи таҳлили протеомикӣ мебошад. Аз ин рӯ, таҳқиқоти минбаъда зарур аст, то механизмҳои паси ин панелҳои биомаркерро боэътимод муайян кунанд. Барои гузаштан ба рушди таҳлили клиникӣ дар асоси MS, самти оянда инчунин истифодаи усулҳои мақсадноки миқдорӣ барои санҷиши миқёси калони биомаркер, ба монанди мониторинги реаксияи интихобӣ ё мувозӣ (62) -ро талаб мекунад. Мо ба наздикӣ мониторинги реаксияи мувозӣ (63) -ро барои тасдиқи бисёре аз тағироти сафедаи CSF дар ин ҷо тавсиф кардем. Якчанд ҳадафҳои афзалиятноки панел бо дақиқии назаррас ҳисоб карда мешаванд, аз ҷумла YWHAZ, ALDOA ва SMOC1, ки мутаносибан ба синапс, метаболизм ва панелҳои илтиҳоби мо харита мекунанд (63). Ҷустуҷӯи мустақили маълумот (DIA) ва дигар стратегияҳои ба MS асосёфта низ метавонанд барои тафтиши ҳадаф муфид бошанд. Буд ва дигарон. (64) Ба наздикӣ нишон дода шуд, ки байни биомаркерҳои AD, ки дар маҷмӯи маълумоти кашфи CSF мо муайян шудаанд ва маҷмӯи маълумоти мустақили DIA-MS, ки аз тақрибан 200 намунаи CSF аз се гурӯҳи гуногуни аврупоӣ иборат аст, такрори назаррас вуҷуд дорад. Ин таҳқиқоти охирин потенсиали панелҳои моро барои табдил додан ба муайянкунии боэътимоди MS дар асоси дастгирӣ мекунанд. Муайян кардани антитело ва аптамер дар асоси анъанавӣ барои рушди минбаъдаи биомаркерҳои калидии AD низ муҳим аст. Аз сабаби кам будани миқдори CSF, муайян кардани ин биомаркерҳо бо истифода аз усулҳои MS-и баландсуръат мушкилтар аст. NEFL ва NRGN ду мисоли биомаркерҳои кам-фаровонии CSF мебошанд, ки дар таҳлили ҳамаҷонибаи мо ба панел нишон дода шудаанд, аммо бо истифода аз стратегияи ягонаи MS мо ба таври эътимодбахш ошкор карда намешаванд. Стратегияҳои мақсаднок дар асоси антителоҳои сершумор, ба монанди PEA, метавонанд ба тағирёбии клиникии ин маркерҳо мусоидат кунанд.
Дар маҷмӯъ, ин тадқиқот як равиши беназири протеомикаро барои муайян кардан ва тафтиш кардани биомаркерҳои CSF AD дар асоси системаҳои гуногун таъмин мекунад. Оптимизатсияи ин панелҳои маркерӣ дар гурӯҳҳои иловагии AD ва платформаҳои MS метавонад барои пешрафти стратификация ва табобати хатари AD умедбахш бошад. Тадқиқотҳое, ки сатҳи тӯлонии ин панелҳоро бо мурури замон арзёбӣ мекунанд, инчунин барои муайян кардани он, ки кадом омезиши маркерҳо хатари бемории барвақт ва тағирёбии шиддати бемориро беҳтар аст, муҳим аст.
Ба истиснои 3 намунае, ки аз ҷониби CSF нусхабардорӣ шудааст, ҳама намунаҳои CSF, ки дар ин тадқиқот истифода шудаанд, таҳти сарпарастии Эмори ADRC ё муассисаҳои тадқиқотии ба ҳам наздик ҷамъоварӣ шудаанд. Дар ин таҳқиқоти протеомика ҳамагӣ чор маҷмӯи намунаҳои Emory CSF истифода шуданд. Дар гурӯҳи CSF муайян карда шуд, ки намунаҳои 20 назорати солим ва 20 беморони AD доранд. Нусхаи CSF 1 намунаҳоро аз 32 назорати солим, 31 шахсони AsymAD ва 33 шахсони AD дар бар мегирад. Нусхаи CSF 2 дорои 147 назорат ва 150 намунаи AD мебошад. Когорти репликатсияи бисёркасабии CSF 4 18 назорат, 17 AD, 19 ALS, 13 PD ва 11 FTD-ро дар бар гирифт. Тибқи созишномае, ки Шӯрои баррасии институтсионалии Донишгоҳи Эмори тасдиқ кардааст, ҳамаи иштирокчиёни омӯзиши Эмори розигии огоҳона гирифтанд. Мувофиқи 2014 Институти Миллии Дастур оид ба таҷрибаи беҳтарини пиршавӣ барои марказҳои Алтсгеймер (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), моеъи мағзи сар тавассути пунксияи lumbar ҷамъоварӣ ва захира карда шуд. Беморони назорат ва AsymAD ва AD дар клиникаи неврологияи маърифатии Эмори ё Гоизуета ADRC арзёбии стандартии маърифатиро гирифтанд. Намунаҳои моеъи мағзи сар аз ҷониби INNO-BIA AlzBio3 Luminex барои ELISA Aβ1-42, таҳлили умумии tau ва p-tau (65) санҷида шуданд. Арзишҳои ELISA барои дастгирии таснифоти ташхисии субъектҳо дар асоси меъёрҳои муқарраршудаи буридани биомаркери AD истифода мешаванд (66, 67). Маълумоти асосии демографӣ ва ташхисӣ барои дигар ташхисҳои CSF (FTD, ALS ва PD) инчунин аз Emory ADRC ё муассисаҳои тадқиқотии вобаста ба даст оварда мешаванд. Метамаълумоти мухтасари парвандаро барои ин парвандаҳои Эмори CSF дар Ҷадвали S1A пайдо кардан мумкин аст. Хусусиятҳои когорти такрории CSF 3-и Швейтсария қаблан нашр шуда буданд (45).
CSF намунаро ёфт. Бо мақсади баланд бардоштани умқи кашфи мо дар бораи маҷмӯи маълумоти CSF, истеъмоли иммунии сафедаҳои фаровон пеш аз трипсинизатсия анҷом дода шуд. Хулоса, 130 мкл CSF аз 40 намунаи инфиродии CSF ва ҳаҷми баробар (130 мкл) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) дар сутуни чарх (Thermo Fisher Scientific, дар ҳуҷраи A89868) ҷойгир карда шуданд. Ҳарорат Инкубатсия). Пас аз чарх задани 15 дақиқа, намунаро дар 1000 г барои 2 дақиқа центрифуга кунед. Таҷҳизоти филтри ултрацентрифугаи 3К (Millipore, UFC500396) барои консентратсияи намунаи партов тавассути центрифуга дар 14,000г барои 30 дақиқа истифода шуд. Ҳама ҳаҷми намунаҳоро то 75 мкл бо шӯри фосфати буферӣ ҳал кунед. Консентратсияи сафеда бо усули кислотаи bicinchoninic (BCA) мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда (Thermo Fisher Scientific) арзёбӣ карда шуд. CSF (60 мкл) аз ҳама 40 намуна бо лизил эндопептидаза (LysC) ва трипсин ҳазм карда шуд. Хулоса, намуна бо 1,2 мкл 0,5 М трис-2(-карбоксиэтил)-фосфин ва 3 мкл 0,8 М хлороацетамид дар 90°C барои 10 дақиқа кам карда, алкилизатсия карда шуд ва сипас дар ваннаи об барои 15 дақиқа соникатсионӣ карда шуд. Намуна бо буфери 193 мкл 8 М мочевина [8 М мочевина ва 100 мМ NaHPO4 (pH 8.5)] то консентратсияи ниҳоии 6 М мочевина илова карда шуд. LysC (4,5 мкг; Вако) барои ҳозимаи шабона дар ҳарорати хонагӣ истифода мешавад. Сипас намуна то 1 М мочевина бо 50 мм бикарбонати аммоний (ABC) (68) омехта карда шуд. Миқдори баробар (4,5 мкг) трипсин (Промега) илова кунед ва сипас намунаро барои 12 соат инкубатсия кунед. Маҳлули пептидҳои ҳазмшударо то консентратсияи ниҳоии 1% кислотаи формин (FA) ва 0,1% кислотаи trifloroacetic (TFA) (66) кислота кунед ва сипас бо сутуни 50 мг Sep-Pak C18 (Обҳо) тавре ки дар боло тавсиф шудааст (25) . Сипас пептид дар 1 мл 50% ацетонитрил (ACN) элюта карда шуд. Барои стандартизатсияи миқдори сафедаҳо дар байни гурӯҳҳо (25), 100 мкл аликвотҳо аз ҳамаи 40 намунаи CSF барои тавлиди намунаи омехта муттаҳид карда шуданд, ки баъдан ба панҷ намунаи глобалии стандарти дохилӣ (GIS) (48) тақсим карда шуд. Ҳама намунаҳои инфиродӣ ва стандартҳои омехта бо вакууми баландсуръат (Labconco) хушк мешаванд.
CSF намунаро нусхабардорӣ мекунад. Даён ва ҳамкасбон қаблан камшавии иммунитет ва ҳозимаи CSF нусхаи 3 намунаро тавсиф карда буданд (45, 46). Намунаҳои такрории боқимонда ба таври инфиродӣ аз масуният маҳрум карда нашудаанд. Ин намунаҳои тозанашударо дар трипсин, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, ҳазм кунед (17). Барои ҳар як таҳлили такрорӣ, 120 мкл аликвотҳои пептиди элюташуда аз ҳар як намуна якҷоя карда шуданд ва ба аликвотҳои баробари ҳаҷм тақсим карда шуданд, то ҳамчун стандарти дохилии ҷаҳонии тамғаи TMT истифода шаванд (48). Ҳама намунаҳои инфиродӣ ва стандартҳои омехта бо вакууми баландсуръат (Labconco) хушк мешаванд. Бо мақсади баланд бардоштани сигнали сафедаи камбизоатии CSF, бо якҷоя кардани 125 мкл аз ҳар як намуна, барои ҳар як таҳлили такрорӣ як намунаи "мукаммалшуда" омода карда шуд [яъне, намунаи биологӣ, ки намунаи тадқиқотро тақлид мекунад, аммо миқдори дастрас аст. хеле калонтар (37, 69)] ба намунаи омехтаи CSF муттаҳид шудаанд (17). Намунаи омехта пас аз он бо истифода аз 12 мл қатрони High Select Top14 Abundance Protein Removal (Thermo Fisher Scientific, A36372) иммунорӣ карда шуд, тавре ки дар боло тавсиф шудааст, ҳазм карда шуд ва ба тамғагузории сершумори TMT дохил карда шуд.
Вақти интишор: 27 август-2021