Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript пешкаш хоҳем кард.
Термофилҳо микроорганизмҳое мебошанд, ки дар ҳарорати баланд инкишоф меёбанд. Омӯзиши онҳо метавонад маълумоти арзишмандро дар бораи чӣ гуна мутобиқ кардани ҳаёт ба шароити шадид фароҳам орад. Бо вуҷуди ин, бо микроскопҳои муқаррарии оптикӣ ба шароити ҳарорати баланд ноил шудан душвор аст. Якчанд қарорҳои хонагӣ дар асоси гармидиҳии барқии муқовимати маҳаллӣ пешниҳод карда шуданд, аммо ҳалли оддии тиҷоратӣ вуҷуд надорад. Дар ин мақола, мо мафҳуми гармкунии лазерии микроскопро дар майдони назари микроскоп пешниҳод мекунем, то ҳарорати баландро барои омӯзиши термофилҳо ҳангоми ҳалим нигоҳ доштани муҳити корбар таъмин кунем. Гармидиҳии микромикробӣ бо шиддатнокии мӯътадили лазерӣ бо истифода аз субстрати нанозарраҳои тиллоӣ ҳамчун абсорбери нури мувофиқ ва самаранок ба даст оварда мешавад. Таъсири эҳтимолии конвексияи моеъи микромикробӣ, нигоҳдории ҳуҷайра ва ҳаракати термофоретикии центрифуга баррасӣ мешавад. Ин усул дар ду намуд нишон дода шудааст: (i) Geobacillus stearothermophilus, як бактерияи фаъоли термофилӣ, ки дар ҳарорати тақрибан 65°С афзоиш меёбад, ки мо мушоҳида кардем, ки дар зери гармкунии микромикросқаб сабзида, афзоиш ва шино мекунад; (ii) Thiobacillus sp., як археаи оптималии гипертермофилӣ. дар 80°С. Ин кор барои мушоҳидаи оддӣ ва бехатари микроорганизмҳои термофилӣ бо истифода аз асбобҳои муосир ва дастраси микроскопӣ роҳ мекушояд.
Дар тӯли миллиардҳо сол, ҳаёт дар рӯи замин барои мутобиқ шудан ба доираи васеи шароитҳои муҳити зист, ки баъзан аз нуқтаи назари инсонии мо шадид ҳисобида мешаванд, таҳаввул ёфт. Аз ҷумла, баъзе микроорганизмҳои термофилӣ (бактерияҳо, археяҳо, занбӯруғҳо), ки термофилҳо ном доранд, дар ҳарорати аз 45 ° C то 122 ° C1, 2, 3, 4. Термофилҳо дар экосистемаҳои гуногун, аз қабили вентилятсияи гидротермалии баҳр, чашмаҳои гарм зиндагӣ мекунанд. ё минтақаҳои вулканӣ. Тадқиқоти онҳо дар тӯли чанд даҳсолаи охир бо ҳадди аққал ду сабаб таваҷҷуҳи зиёд ба вуҷуд овард. Аввалан, мо метавонем аз онҳо бифаҳмем, ки чӣ тавр термофилҳои 5, 6, ферментҳои 7, 8 ва мембранаҳои 9 дар чунин ҳарорати баланд устуворанд ё чӣ гуна термофилҳо ба дараҷаи шадиди шуоъ тоб оварда метавонанд10. Дуюм, онҳо барои бисёр барномаҳои муҳими биотехнологӣ асос мебошанд1,11,12, аз қабили истеҳсоли сӯзишворӣ13,14,15,16, синтези кимиёвӣ (дигидро, спиртҳо, метан, аминокислотаҳо ва ғ.)17, биомининг18 ва биокатализаторҳои термостабли7 ,11, 13. Аз ҷумла, реаксияи занҷири полимеразӣ (ПЗР)19 дар айни замон як ферментро (Тақ полимераза) дар бар мегирад, ки аз бактерияи термофилии Thermus aquaticus, яке аз аввалин термофилҳои кашфшуда мебошад.
Аммо омухтани термофилхо кори осон нест ва онро дар ягон лабораторияи биологй импровизация кардан мумкин нест. Махсусан, термофилҳои зиндаро дар vitro бо ягон микроскопи рӯшноии стандартӣ мушоҳида кардан мумкин нест, ҳатто бо камераҳои гармидиҳии тиҷоратӣ, ки одатан барои ҳарорати то 40 ° C арзёбӣ мешаванд. Аз солҳои 1990 инҷониб, танҳо якчанд гурӯҳҳои тадқиқотӣ худро ба ҷорӣ намудани системаҳои микроскопияи баландҳарорат (HTM) бахшидаанд. Соли 1994 Глух ва дигарон. Камераи гармидиҳӣ / хунуккунӣ дар асоси истифодаи ҳуҷайраи Peltier таҳия шудааст, ки ҳарорати капиллярҳои росткунҷаи пӯшидаро барои нигоҳ доштани анаэробӣ 20 назорат мекунад. Дастгоҳ метавонад то 100 °С бо суръати 2 °C/с гарм шавад, ки ба муаллифон имкон медиҳад, ки ҳаракати бактерияи гипертермофилии Thermotoga maritima21-ро омӯзанд. Соли 1999 Хорн ва дигарон. Таҷҳизоти хеле шабеҳ таҳия шудааст, ки ҳоло ҳам ба истифодаи капиллярҳои тафсоншуда, ки барои микроскопияи тиҷоратӣ барои омӯзиши тақсимот/пайвастшавии ҳуҷайра мувофиқ аст, асос ёфтааст. Пас аз муддати тӯлонии бефаъолияти нисбӣ, ҷустуҷӯи HTM-ҳои муассир дар соли 2012, бахусус дар робита бо як қатор ҳуҷҷатҳои гурӯҳи Вирт, ки дастгоҳи ихтироъкардаи Хорн ва дигаронро истифода мебурд, дубора оғоз ёфт. Понздах сол пеш харакати шумораи зиёди архейхо, аз чумла гипертермофилхо дар харорати то 100°С бо ёрии капиллярхои тафсон омухта мешуд23,24. Онҳо инчунин микроскопи аслиро барои ба даст овардани гармии тезтар (ба ҷои чанд дақиқа барои расидан ба ҳарорати муқарраршуда ба ҷои 35 дақиқа) тағир доданд ва ба градиенти хаттии ҳарорати зиёда аз 2 см дар саросари муҳити атроф ноил шуданд. Ин дастгоҳи ташаккули градиенти ҳарорат (TGFD) барои омӯзиши ҳаракати бисёр термофилҳо дар доираи градиентҳои ҳарорат дар масофаҳои аз ҷиҳати биологӣ мувофиқ 24, 25 истифода шудааст.
Гарм кардани капиллярҳои пӯшида ягона роҳи мушоҳидаи термофилҳои зинда нест. Дар соли 2012, Кувабара ва дигарон. Камераҳои якдафъаинаи худсохти Pyrex, ки бо илтиёми ба гармӣ тобовар мӯҳр карда шудаанд (Super X2; Cemedine, Ҷопон) истифода шуданд. Намунаҳо дар плитаи гармидиҳии шаффофи дар тиҷорат дастрас ҷойгиршуда (Micro Heat Plate, Корпоратсияи Китазато, Ҷопон), ки қодиранд то 110 ° C гарм кунанд, аммо дар ибтидо барои биоимография пешбинӣ нашудаанд. Муаллифон тақсимоти самараноки бактерияҳои термофилии анаэробӣ (Thermosipho globiformans, вақти дучанд 24 дақиқа) дар ҳарорати 65 ° C мушоҳида карданд. Дар соли 2020, Пулшен ва дигарон. Гармкунии самараноки табақҳои металлии тиҷоратӣ (AttofluorTM, Thermofisher) бо истифода аз ду унсури гармидиҳии хонагӣ: сарпӯш ва саҳна (конфигуратсияи аз ҷониби мошини PCR илҳомёфта) намоиш дода шуд. Ин ассотсиатсия ба ҳарорати якхелаи моеъ оварда мерасонад ва бухоршавӣ ва конденсатсияро дар поёни зарф пешгирӣ мекунад. Истифодаи O-ring аз мубодилаи газ бо муҳити атроф пешгирӣ мекунад. Ин HTM, ки Сулфоскоп ном дорад, барои тасвири Sulfolobus acidocaldarius дар ҳарорати 75 ° C27 истифода шудааст.
Маҳдудияти эътирофшудаи ҳамаи ин системаҳо маҳдудияти истифодаи ҳадафҳои ҳавоӣ буд, ки ҳар гуна ғарқ кардани равған барои чунин ҳарорати баланд ва барои тасвир тавассути намунаҳои шаффофи ғафси >1 мм номувофиқ буд. Маҳдудияти эътирофшудаи ҳамаи ин системаҳо маҳдудияти истифодаи ҳадафҳои ҳавоӣ буд, ки ҳар гуна ғарқ кардани равған барои чунин ҳарорати баланд ва барои тасвир тавассути намунаҳои шаффофи ғафси >1 мм номувофиқ буд. Общепризнанным недостатком тамоми системам ба истифода додани объектхо, посёлкахо барои харорати баланди харорат ва барои ммн11 кардани имкониятхо. Камбудии эътирофшудаи ҳамаи ин системаҳо маҳдудияти истифодаи ҳадафҳои ҳавоӣ буд, зеро ҳама гуна ғарқ кардани равған барои чунин ҳарорати баланд ва барои визуализатсия тавассути намунаҳои шаффофи ғафсии > 1 мм мувофиқ набуд.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适油浸都不适合认限制是限制使用毫米厚的透明样品成像。 Маҳдудияти эътирофшудаи ҳамаи ин системаҳо маҳдудияти истифодаи оинаи бо ҳаво воридшаванда мебошад, зеро ҳар гуна ғарқ кардани равған барои тасвири намунаҳои шаффофи ғафсӣ аз 1 мм дар чунин ҳарорати баланд номувофиқ аст. Общепризнанным недостатком дар тамоми система и истифодаи объектхои объ-ектхо, любое иммерсионное погружение дар масолехи непригодно барои чунин харорати баланд ва визуализации ба кадри зарурй > мм1 таъмин карда мешавад. Камбудии эътирофшудаи ҳамаи ин системаҳо истифодаи маҳдуди линзаҳои ҳавоӣ мебошад, ҳар гуна ғарқ кардани равған барои чунин ҳарорати баланд номувофиқ аст ва визуализатсия тавассути намунаҳои шаффофи ғафсии >1 мм.Чанде пеш, ин маҳдудият аз ҷониби Чарлз-Орзаг ва дигарон бардошта шуд. 28, ки дастгоҳеро таҳия кардааст, ки дигар гармиро дар атрофи системаи манфиатдор таъмин намекунад, балки дар дохили худи шишаи сарпӯш, ки бо қабати тунуки шаффофи резистор аз ITO (оксиди индиум-тин) пӯшонида шудааст. Сарпӯшро аз қабати шаффоф гузаштани ҷараёни барқро то 75 °С гарм кардан мумкин аст. Аммо муаллиф инчунин бояд объективро то объектив гарм кунад, вале на бештар аз 65 °C, то осеб надиҳад.
Ин корҳо нишон медиҳанд, ки коркарди микроскопияи оптикии самараноки ҳарорати баланд ба таври васеъ қабул карда нашудааст, аксар вақт таҷҳизоти хонагиро талаб мекунад ва аксар вақт бо ҳисоби ҳалли фазоӣ ба даст оварда мешавад, ки ин камбудии ҷиддӣ аст, зеро микроорганизмҳои термофилӣ аз якчанд микроорганизмҳо калонтар нестанд. микрометр. Ҳаҷми камшавии гармидиҳӣ калиди ҳалли се мушкилоти хоси HTM мебошад: ҳалли сусти фазоӣ, инерсияи баланди гармӣ ҳангоми гарм шудани система ва гармшавии зарарноки унсурҳои атроф (равғани обкашӣ, линзаи объективӣ ... ё дасти корбар) дар ҳарорати аз ҳад зиёд. ).
Дар ин мақола мо як HTM-ро барои мушоҳидаи термофилӣ пешниҳод мекунем, ки ба гармкунии муқовимат асос надорад. Ба ҷои ин, мо ба гармии маҳаллӣ дар як минтақаи маҳдуди майдони назари микроскоп тавассути шуоъдиҳии лазерии субстрати рӯшноӣ ноил гардидем. Тақсимоти ҳарорат бо истифода аз микроскопияи миқдорӣ (QPM) нишон дода шуд. Самаранокии ин усулро Geobacillus stearothermophilus, як бактерияи термофилии ҳаракаткунанда, ки дар ҳарорати тақрибан 65°С тавлид мекунад ва вақти дучандшавии кӯтоҳ дорад (тақрибан 20 дақиқа) ва Sulfolobus shibatae, гипертермофиле, ки дар ҳарорати оптималӣ дар 80°С (archaea) меафзояд, нишон медиҳад. барои тасвир кардан. Суръати муътадили такроршавй ва шиноварй вобаста ба харорат мушохида карда шуд. Ин лазерии HTM (LA-HTM) аз рӯи ғафсии қабати пӯшиш ё хусусияти ҳадаф (таъмини ҳаво ё равған) маҳдуд намешавад. Ин имкон медиҳад, ки ҳама гуна линзаҳои ҳалли баланд дар бозор истифода шаванд. Он инчунин аз сабаби инерсияи гармӣ аз гармкунии суст азоб намекашад (дар миқёси миллисония ба гармкунии фаврӣ ноил мешавад) ва танҳо ҷузъҳои дар тиҷорат дастрасро истифода мебарад. Ягона нигарониҳои нави бехатарӣ бо мавҷудияти нурҳои лазерии пурқувват (одатан то 100 мВт) дар дохили дастгоҳ ва эҳтимолан тавассути чашм, ки айнаки муҳофизатиро талаб мекунанд, алоқаманд аст.
Принсипи LA-HTM аз истифодаи лазер барои гарм кардани намуна дар дохили майдони назари микроскоп иборат аст (расми 1а). Барои ин, намуна бояд рӯшноӣ бигирад. Барои истифода бурдани қувваи лазерии оқилона (камтар аз 100 мВт) мо ба азхудкунии нур аз ҷониби муҳити моеъ такя накардаем, балки азхудкунии намунаро тавассути пӯшонидани субстрат бо нанозарраҳои тиллоӣ ба таври сунъӣ зиёд кардем (расми 1c). Гарм кардани нанозаррачаҳои тиллоӣ бо рӯшноӣ барои соҳаи плазмоникаи термикӣ аҳамияти асосӣ дорад ва барномаҳои пешбинишуда дар биотибб, нанохимия ё ҷамъоварии нури офтоб29,30,31. Дар тӯли чанд соли охир, мо ин LA-HTM-ро дар якчанд таҳқиқоти марбут ба барномаҳои плазмаи гармӣ дар физика, химия ва биология истифода кардем. Мушкилоти асосӣ бо ин усул дар намоиш додани профили ниҳоии ҳарорат аст, зеро ҳарорати баланд ба минтақаи микрошкала дар дохили намуна маҳдуд аст. Мо нишон додем, ки харитасозии ҳароратро бо интерферометри чормавҷи қаҳваранг, усули оддӣ, баландсифат ва хеле ҳассоси микроскопияи фазавии миқдорӣ дар асоси истифодаи панҷараҳои дифраксионии дученака (инчунин бо номи торҳои салиб маълум) ба даст овардан мумкин аст. 33,34,35,36. Эътимоднокии ин усули микроскопияи гармидиҳӣ, ки ба микроскопияи убури мавҷӣ (CGM) асос ёфтааст, дар даҳҳо мақолаҳо, ки дар даҳсолаи охир нашр шудаанд37,38,39,40,41,42,43 нишон дода шудаанд.
Схемаи монтажи микроскопи параллели лазерй гармкунй, шаклгирй ва харорат. b Геометрияи намуна аз камераи AttofluorTM иборат аст, ки дорои пӯшиши бо нанозаррачаҳои тиллоӣ фаро гирифта шудааст. c Ба намуна бодиққат назар кунед (на барои миқёс). d профили якхелаи нури лазерӣ ва (д) тақсимоти минбаъдаи ҳароратро дар ҳавопаймои намунавии нанозарраҳои тиллоӣ ифода мекунад. f профили шуои лазерии ҳалқадорест, ки барои тавлиди ҳарорати якхела мувофиқ аст, тавре ки дар моделиронии тақсимоти ҳарорати натиҷа, ки дар (g) нишон дода шудааст, нишон дода шудааст. Сатри миқёс: 30 мкм.
Аз ҷумла, мо ба наздикӣ гарм кардани ҳуҷайраҳои ширхӯронро бо LA-HTM ва CGM ба даст овардем ва аксуламалҳои зарбаи гармии ҳуҷайраро дар ҳудуди 37-42 ° C пайгирӣ кардем, ки татбиқи ин усулро барои тасвири як ҳуҷайраи зинда нишон дод. Аммо истифодаи LA-HTM барои омӯзиши микроорганизмҳо дар ҳарорати баланд якхела нест, зеро он нисбат ба ҳуҷайраҳои ширхӯрон эҳтиёткортарро талаб мекунад: аввалан, дахҳо дараҷа (на якчанд дараҷа) гарм кардани поёни муҳити атроф оварда мерасонад. ба градиенти пурқуввати ҳарорати амудӣ. метавонад конвексияи моеъро 44 ба вуҷуд оварад, ки агар ба субстрат сахт часпонида нашавад, боиси ҳаракати номатлуб ва омехташавии бактерияҳо мегардад. Ин конвексияро тавассути кам кардани ғафсии қабати моеъ бартараф кардан мумкин аст. Бо ин мақсад, дар ҳама таҷрибаҳои дар поён овардашуда, суспензияҳои бактериявӣ дар байни ду пӯшиши тақрибан 15 мкм ғафсӣ дар дохили косаи металлӣ ҷойгир карда шуданд (AttofluorTM, Thermofisher, расми 1b,c). Дар асл, конвексияро пешгирӣ кардан мумкин аст, агар ғафсии моеъ аз андозаи нури лазери гармкунӣ хурдтар бошад. Сониян, кор кардан дар чунин геометрияи маҳдуд метавонад организмҳои аэробиро буғ кунад (ниг. Расми S2). Аз ин мушкилот метавон бо истифода аз субстрате, ки ба оксиген гузаранда (ё ягон гази дигари ҳаётан муҳим), бо гузоштани футурҳои ҳаво дар дохили пӯшиш ё пармакунӣ дар қабати болоӣ (ниг. расми S1) 45 пешгирӣ кард. Дар ин тадқиқот мо ҳалли охиринро интихоб кардем (Расмҳои 1b ва S1). Ниҳоят, гармкунии лазерӣ тақсимоти яксони ҳароратро таъмин намекунад. Ҳатто дар ҳамон шиддатнокии шуои лазерӣ (расми 1г) тақсимоти ҳарорат якранг нест, балки аз ҳисоби диффузияи гармӣ ба тақсимоти Гаусс шабоҳат дорад (расми 1е). Вакте ки максад мукаррар намудани харорати дакик дар майдони назар барои омузиши системахои биологи мебошад, профилхои нобаробар идеал нестанд ва инчунин метавонанд ба харакати термофоретикии бактерияхо оварда расонанд, агар онхо ба субстрат часпида нашаванд (ниг. Расми S3, S4)39. Бо ин мақсад, мо модулятори нури фазоӣ (SLM) -ро барои шакл додани нури лазерии инфрасурх мувофиқи шакли ҳалқа (расми 1f) дар ҳамвории намуна истифода бурдем, то ба тақсимоти комилан яксони ҳарорат дар як минтақаи геометрии додашуда ноил гардем. сарфи назар аз диффузияи гармидиҳӣ (расми 1d) 39 , 42, 46. Барои пешгирӣ кардани бухоршавии муҳити атроф як қабати болоиро ба болои табақчаи металлӣ ҷойгир кунед (расми 1б) ва ҳадди аққал чанд рӯзро мушоҳида кунед. Азбаски ин пӯшиши боло мӯҳр карда нашудааст, дар ҳолати зарурӣ муҳити иловагиро дар вақти дилхоҳ ба осонӣ илова кардан мумкин аст.
Барои нишон додани чӣ гуна кор кардани LA-HTM ва нишон додани татбиқи он дар тадқиқоти термофилӣ, мо бактерияҳои аэроби Geobacillus stearothermophilus-ро, ки ҳарорати оптималии афзоиш тақрибан 60-65 ° C доранд, омӯхтанд. Бактерия инчунин дорои флагелла ва қобилияти шиноварӣ мебошад, ки нишондиҳандаи дигари фаъолияти муқаррарии ҳуҷайраҳоро таъмин мекунад.
Намунаҳо (расми 1б) дар 60°C барои як соат қаблан инкубатсия карда шуданд ва сипас дар дорандаи намунаи LA-HTM ҷойгир карда шуданд. Ин пеш аз инкубатсия ихтиёрӣ аст, аммо бо ду сабаб муфид аст: Якум, вақте ки лазер фурӯзон мешавад, он боиси якбора афзоиш ва тақсим шудани ҳуҷайраҳо мегардад (ниг. филми M1 дар Маводҳои иловагӣ). Бе инкубатсия пеш аз ин, афзоиши бактерияҳо одатан тақрибан 40 дақиқа ба таъхир меафтад, вақте ки майдони нав дар намуна гарм карда мешавад. Дуюм, 1 соат пеш аз инкубатсия ба часпидани бактерияҳо ба пӯшиш мусоидат намуда, аз берун рафтани ҳуҷайраҳо дар натиҷаи термофорез ҳангоми фурӯзон шудани лазер аз майдони назар пешгирӣ кард (ниг. Филми M2 дар Маводҳои иловагӣ). Термофорез ҳаракати зарраҳо ё молекулаҳо дар баробари градиенти ҳарорат аст, одатан аз гарм ба сард ва бактерияҳо истисно нестанд43,47. Ин таъсири номатлуб дар як минтақаи додашуда бо истифода аз SLM барои шакл додани нури лазерӣ ва ба даст овардани тақсимоти ҳамвори ҳарорат бартараф карда мешавад.
Дар расм. Тасвири 2 тақсимоти ҳароратро, ки тавассути CGM чен карда шудааст, нишон медиҳад, ки тавассути радиатсия кардани субстрати шишагии бо нанозаррачаҳои тиллоӣ бо нури лазерии ҳалқадор гирифташуда (расми 1f). Дар тамоми майдоне, ки шуои лазер фаро гирифтааст, таксимоти якхелаи харорат мушохида карда шуд. Ин минтақа ба 65 ° C, ҳарорати оптималии афзоиш муқаррар карда шуд. Берун аз ин минтақа, каҷи ҳарорат табиатан ба \(1/r\) меафтад (ки \(r\) координатаи радиал аст).
Харитаи ҳарорати андозагирии CGM, ки тавассути истифодаи чӯби лазерии ҳалқавӣ барои шуоъ кардани қабати нанозарраҳои тиллоӣ барои ба даст овардани профили ҳарорати ҳамвор дар майдони даврашакл ба даст оварда шудааст. б Изотерми харитаи харорат (а). Контури нури лазерӣ бо доирачаи нуқтадори хокистарӣ тасвир шудааст. Таҷриба ду маротиба такрор карда шуд (ниг. Маводҳои иловагӣ, Расми S4).
Зиндагии ҳуҷайраҳои бактериявӣ барои якчанд соат бо истифода аз LA-HTM назорат карда шуд. Дар расм. 3 фосилаи вақтро барои чор тасвири аз филми 3 соату 20 дақиқа гирифташуда нишон медиҳад (Филми M3, Маълумоти иловагӣ). Мушоҳида карда шуд, ки бактерияҳо дар минтақаи даврашакл, ки лазер муайян кардааст, дар он ҷо ҳарорати оптималии он ба 65 ° C наздик шуда, фаъолона паҳн мешаванд. Баръакс, афзоиши ҳуҷайраҳо ҳангоми дар давоми 10 сония поёнтар аз 50 ° C паст шудани ҳарорат ба таври назаррас коҳиш ёфт.
Тасвирҳои умқи оптикии бактерияҳои Г. stearothermophilus пас аз гармкунии лазерӣ дар вақтҳои гуногун, (а) t = 0 дақиқа, (б) 1 соат 10 дақиқа, (в) 2 соат 20 дақиқа, (г) 3 соат 20 дақиқа, аз 200 Аз филми якдақиқаӣ (филми M3 дар Маълумоти иловагӣ оварда шудааст) гирифта шудааст, ки дар харитаи ҳарорати мувофиқ ҷойгир карда шудааст. Лазер дар вақти \(t=0\) фурӯзон мешавад. Ба тасвири шиддат изотермҳо илова карда шуданд.
Барои муайян кардани миқдори минбаъдаи афзоиши ҳуҷайраҳо ва вобастагии он аз ҳарорат, мо афзоиши биомассаи колонияҳои гуногуни бактерияҳои дар аввал ҷудошударо дар майдони назари Movie M3 чен кардем (расми 4). Бактерияҳои волидайн дар оғози ташаккули воҳиди хурди колония (mCFU) интихобшуда дар расми S6 нишон дода шудаанд. Андозагирии массаи хушк бо камераи CGM 48 гирифта шуд, ки барои харитаи тақсимоти ҳарорат истифода мешуд. Қобилияти CGM барои чен кардани вазн ва ҳарорати хушк қувваи LA-HTM мебошад. Тавре ки интизор мерафт, ҳарорати баланд боиси афзоиши босуръати бактерияҳо гардид (расми 4а). Тавре ки дар нақшаи ним-лог дар расми 4b нишон дода шудааст, афзоиш дар ҳама ҳароратҳо пас аз афзоиши экспоненсиалӣ сурат мегирад, ки дар он маълумот функсияи экспоненсиалии \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ истифода мешавад. {{ \mbox{cst}}}\), ки \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – вақти тавлид (ё вақти дучанд), \( g =1/ \tau\) - суръати афзоиш (шумораи тақсимот дар як воҳиди вақт). Дар расм. 4c суръати мувофиқи афзоиш ва вақти тавлидро ҳамчун функсияи ҳарорат нишон медиҳад. mCFU-ҳои босуръат афзоянда бо сер шудани афзоиш пас аз ду соат тавсиф мешаванд, рафтори пешбинишуда аз сабаби зичии баланди бактериявӣ (монанд ба марҳилаи статсионарӣ дар фарҳангҳои моеъи классикӣ). Шакли умумии \(г\чап(Т\рост)\) (расми 4в) ба каљи думарњилаи пешбинишавандаи Г.стеаротермофил бо суръати оптималии афзоиш дар атрофи 60-65°С мувофиќат мекунад. Бо истифода аз модели кардиналӣ маълумотро мувофиқ кунед (Расми S5)49, ки дар он \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, ки бо дигар арзишҳои дар адабиёт овардашуда мувофиқ аст49. Гарчанде ки параметрҳои вобаста ба ҳарорат такроршавандаанд, суръати максималии афзоиши \({G}_{0}\) метавонад аз як таҷриба ба дигараш фарқ кунад (ниг. ба расмҳои S7-S9 ва филми M4). Баръакси параметрҳои мувофиқи ҳарорат, ки бояд универсалӣ бошанд, суръати максималии афзоиш аз хосиятҳои муҳити атроф (мавҷудияти моддаҳои ғизоӣ, консентратсияи оксиген) дар доираи геометрияи микроскопии мушоҳидашуда вобаста аст.
афзоиши микробҳо дар ҳарорати гуногун. mCFU: Воҳидҳои ташаккули колонияи миниётуравӣ. Маълумоте, ки аз видеои як бактерия дар градиенти ҳарорат афзоиш меёбад (филми M3). б Ҳамон тавре ки (a), миқёси нимлогарифмӣ. c Суръати афзоиш\(\tau\) ва вақти тавлид\(g\) аз регрессияи хатӣ ҳисоб карда шудааст (b). Сутунҳои хатогиҳои уфуқӣ: диапазони ҳарорате, ки дар он mCFUҳо ҳангоми афзоиш ба майдони дидан васеъ шуданд. Барҳои хатогиҳои амудӣ: хатои стандартии регрессияи хатӣ.
Илова ба афзоиши муқаррарӣ, баъзе бактерияҳо баъзан ҳангоми гармкунии лазерӣ ба назар мерасанд, ки ин рафтори пешбинишаванда барои бактерияҳо бо флагелла мебошад. Филми M5 дар маълумоти иловагӣ чунин фаъолиятҳои шиноварӣ нишон медиҳад. Дар ин таҷриба, радиатсияи якхелаи лазерӣ барои эҷоди градиенти ҳарорат истифода шуд, ки дар расмҳои 1d, e ва S3 нишон дода шудааст. Дар расми 5 ду пайдарпаии тасвири аз филми M5 интихобшуда нишон дода шудааст, ки нишон медиҳад, ки як бактерия ҳаракати самтнокро нишон медиҳад, дар ҳоле ки ҳамаи бактерияҳои дигар бе ҳаракат мемонанд.
Ду чаҳорчӯбаи вақт (а) ва (б) шиноварии ду бактерияи гуногунро нишон медиҳанд, ки бо доираҳои нуқтадор ишора шудаанд. Тасвирҳо аз филми M5 гирифта шудаанд (ҳамчун маводи иловагӣ пешниҳод карда мешаванд).
Дар мавриди G. stearothermophilus ҳаракати фаъоли бактерияҳо (расми 5) пас аз чанд сония ба кор андохтани шуои лазер оғоз мешавад. Ин мушоҳида вокуниши муваққатии ин микроорганизми термофилиро ба баланд шудани ҳарорат, тавре ки Мора ва дигарон мушоҳида кардаанд, таъкид мекунад. 24 . Мавзӯи ҳаракати бактерияҳо ва ҳатто термотаксисро метавон минбаъд бо истифода аз LA-HTM таҳқиқ кард.
Шиноварии микробҳоро набояд бо дигар намудҳои ҳаракати ҷисмонӣ омехта кард, аз ҷумла (i) ҳаракати Броунӣ, ки ба назар ҳаракати бесарусомонӣ бе самти муайян ба назар мерасад, (ii) конвексия 50 ва термофорез 43, ки аз ҳаракати мунтазами ҳаракат дар баробари ҳарорат иборат аст. градиент.
Г. stearothermophilus бо қобилияти тавлиди қаламчаҳои тобовар (ташаккули спора) ҳангоми дучор шудан ба шароити номусоиди муҳити зист ҳамчун муҳофизат маълум аст. Вақте ки шароити муҳити зист дубора мусоид мешавад, спораҳо месабзанд, ҳуҷайраҳои зиндаро ташкил медиҳанд ва афзоишро дубора оғоз мекунанд. Гарчанде ки ин раванди споруляция / нашъунамо маълум аст, он ҳеҷ гоҳ дар вақти воқеӣ мушоҳида нашудааст. Бо истифода аз LA-HTM, мо дар ин ҷо мушоҳидаи аввалини ҳодисаҳои сабзиши Г. stearothermophilus гузориш медиҳем.
Дар расм. 6а тасвирҳои бо гузашти вақт умқи оптикӣ (OT) бо истифода аз маҷмӯи CGM аз 13 спора ба даст овардашударо нишон медиҳад. Дар давоми тамоми вақти ҷамъоварӣ (15 соат 6 дақиқа, \(t=0\) - оғози гармкунии лазерӣ), 4 аз 13 спора сабзида, дар нуқтаҳои пай дар пай \(t=2\) соат, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' ва \(11\) h \(30\)'. Гарчанде ки танҳо яке аз ин рӯйдодҳо дар расми 6 нишон дода шудааст, дар филми M6 дар маводи иловагӣ 4 ҳодисаи сабзишро мушоҳида кардан мумкин аст. Ачоиб он аст, ки нашъунамои тасодуфй ба назар мерасад: на хамаи спорахо, сарфи назар аз як хел тагйир ёфтани шароити мухит неш зада, дар як вакт неш зада мебароянд.
a Time-lapse иборат аз 8 тасвири OT (таъмини нафт, 60x, 1,25 NA ҳадаф) ва (б) эволютсияи биомассаи агрегатҳои G. stearothermophilus. в (б) Дар ҷадвали нимлогӣ барои нишон додани хатти суръати афзоиш (хатти рахнашуда) кашида шудааст.
Дар расм. 6b,c биомассаи популятсияҳои ҳуҷайраҳоро дар майдони назар ҳамчун функсияи вақт дар тамоми давраи ҷамъоварии маълумот нишон медиҳад. Пӯсидани зуди массаи хушк дар \(t=5\)h дар расм мушоҳида шудааст. 6б, в, аз сабаби аз майдони назар баромадани баъзе ячейкахо. Суръати афзоиши ин чор ходиса \(0,77\pm 0,1\) h-1 аст. Ин қимат аз суръати афзоиши бо расми 3. 3 ва 4 алоқаманд аст, ки дар он ҳуҷайраҳо муътадил мерӯянд. Сабаби афзоиши суръати афзоиши G. stearothermophilus аз спораҳо норавшан аст, аммо ин ченакҳо таваҷҷӯҳи LA-HTM-ро нишон медиҳанд ва дар сатҳи як ҳуҷайра (ё дар сатҳи ягонаи mCFU) кор мекунанд, то дар бораи динамикаи ҳаёти ҳуҷайра маълумоти бештар гиранд. .
Барои нишон додани минбаъдаи гуногунҷанбаи LA-HTM ва иҷрои он дар ҳарорати баланд, мо афзоиши Sulfolobus shibatae, як археаи гипертермофилии ацидофиликиро бо ҳарорати оптималии афзоиши 80 ° C51 тафтиш кардем. Дар муқоиса бо G. stearothermophilus, ин архейҳо инчунин морфологияи хеле гуногун доранд, ки ба кураҳои 1 микрон (коккҳо) шабоҳат доранд, на чубҳои дароз (бацилла).
Тасвири 7а аз тасвирҳои пайдарпайи умқи оптикии S. shibatae mCFU, ки бо истифода аз CGM гирифта шудааст, иборат аст (ниг. Филми бадеии M7 дар Маводҳои иловагӣ). Ин mCFU дар тақрибан 73 ° C, дар зери ҳарорати оптималии 80 ° C, аммо дар доираи ҳарорат барои афзоиши фаъол меафзояд. Мо ҳодисаҳои тақсимшавии сершуморро мушоҳида кардем, ки пас аз чанд соат mCFU-ро ба микроангураҳои археа монанд карданд. Аз ин тасвирҳои OT, биомассаи mCFU бо мурури замон чен карда шуд ва дар расми 7b пешниҳод карда шуд. Ҷолиб он аст, ки S. shibatae mCFUs афзоиши хатиро нишон дод, на афзоиши экспоненсиалӣ, ки бо G. stearothermophilus mCFUs мушоҳида мешавад. Дар бораи хусусияти суръати афзоиши ҳуҷайраҳо 52 баҳси тӯлонӣ вуҷуд дорад: дар ҳоле ки баъзе тадқиқотҳо суръати афзоиши микробҳоро, ки ба андозаи онҳо мутаносиб (афзоиши экспоненсиалӣ) мебошанд, гузориш медиҳанд, дигарон суръати доимиро нишон медиҳанд (афзоиши хатӣ ё дуинеарӣ). Тавре Tzur et al.53 тавзеҳ додааст, фарқи байни афзоиши экспоненсиалӣ ва (би) хатӣ дақиқии <6% дар андозагирии биомассаро талаб мекунад, ки барои аксари усулҳои QPM, ҳатто бо ҷалби интерферометрия дастрас нест. Тавре Tzur et al.53 тавзеҳ додааст, фарқи байни афзоиши экспоненсиалӣ ва (би) хатӣ дақиқии <6% дар андозагирии биомассаро талаб мекунад, ки барои аксари усулҳои QPM, ҳатто бо ҷалби интерферометрия дастрас нест. Как эълон Цур и др.53, различение экспоненциального ва (би)линейного роста требует точности <6% дар измерениях биомасса, ки недостижимо барои большинства методов QPM, аз тарафи интерферометрии истифода бурда мешавад. Тавре Зур ва диг.53 шарҳ додааст, фарқи байни афзоиши экспоненсиалӣ ва (би) хатӣ дақиқии <6% дар андозагирии биомассаро талаб мекунад, ки барои аксари усулҳои QPM ҳатто бо истифода аз интерферометрия, дастнорас аст.Чунон ки Зур ва дигарон шарх доданд. 53, фарқи байни афзоиши экспоненсиалӣ ва (би) хатӣ дар андозагирии биомасса камтар аз 6% дақиқро талаб мекунад, ки барои аксари усулҳои QPM, ҳатто ҳангоми истифодаи интерферометрия, дастнорас аст. CGM ин дақиқиро бо дақиқии зерсохтор дар андозагирии биомасса ба даст меорад36,48.
Вақти гузашти иборат аз 6 тасвири OT (таъмини нафт, 60х, ҳадафи NA 1.25) ва (б) эволютсияи биомассаи микро-CFU, ки бо CGM чен карда шудааст. Барои маълумоти бештар ба филми M7 нигаред.
Афзоиши комилан хаттии S. shibatae ғайричашмдошт буд ва то ҳол гузориш нашудааст. Аммо, афзоиши экспоненсиалӣ дар назар аст, ҳадди аққал аз он сабаб, ки бо мурури замон, тақсимоти сершумори ҳуҷайраҳои 2, 4, 8, 16 ... ба амал меоянд. Мо фарзия кардем, ки афзоиши хатӣ метавонад аз сабаби ҷилавгирӣ аз ҳуҷайраҳо аз бастабандии зиччи ҳуҷайраҳо бошад, ҳамон тавре ки афзоиши ҳуҷайраҳо суст мешавад ва дар ниҳоят вақте ки зичии ҳуҷайра хеле баланд аст, ба ҳолати нофаъол мерасад.
Мо бо муҳокимаи панҷ нуқтаи таваҷҷӯҳи зерин дар навбати худ хулоса мебарорем: кам кардани ҳаҷми гармкунӣ, кам кардани инерсияи гармӣ, таваҷҷӯҳ ба нанозарраҳои тилло, таваҷҷӯҳ ба микроскопияи миқдорӣ ва диапазони эҳтимолии ҳарорат, ки дар он LA-HTM истифода мешавад.
Дар муқоиса бо гармидиҳии муқовиматкунанда, гармкунии лазерӣ, ки барои таҳияи HTM истифода мешавад, як қатор бартариҳоро пешниҳод мекунад, ки мо дар ин таҳқиқот нишон медиҳем. Аз ҷумла, дар муҳити моеъ дар майдони назари микроскоп ҳаҷми гармкунӣ дар ҳудуди чанд (10 мкм) 3 ҳаҷм нигоҳ дошта мешавад. Бо ин роҳ, танҳо микробҳои мушоҳидашуда фаъоланд, дар ҳоле ки бактерияҳои дигар нофаъол мебошанд ва онҳоро барои омӯзиши минбаъдаи намуна истифода бурдан мумкин аст - ҳар дафъае, ки ҳарорати навро тафтиш кардан лозим аст, тағир додани намуна вуҷуд надорад. Илова бар ин, гармкунии микромикробӣ имкон медиҳад, ки доираи васеи ҳароратҳо бевосита тафтиш карда шавад: Расми 4в аз филми 3-соата (Филми М3) гирифта шудааст, ки одатан омода ва санҷиши якчанд намунаро талаб мекунад - яктогӣ барои ҳар як намунаи мавриди омӯзиш. y ҳароратест, ки шумораи рӯзҳои таҷрибаро ифода мекунад. Кам кардани ҳаҷми тафсон инчунин тамоми ҷузъҳои оптикии микроскопро, бахусус линзаи объективӣ, дар ҳарорати хонагӣ нигоҳ медорад, ки то имрӯз як мушкили умдаи ҷомеа буд. LA-HTM-ро бо ҳама гуна линзаҳо, аз ҷумла линзаҳои ғарқкунандаи равған истифода бурдан мумкин аст ва дар ҳарорати хонагӣ ҳатто дар ҳарорати аз ҳад зиёд дар майдони назар меистад. Маҳдудияти асосии усули гармидиҳии лазерӣ, ки мо дар ин таҳқиқот гузориш медиҳем, дар он аст, ки ҳуҷайраҳое, ки часпида надоранд ё шино намекунанд, метавонанд аз майдони назар дур бошанд ва омӯхтани онҳо душвор бошад. Як роҳи ҳалли он метавонад истифода бурдани линзаҳои васеъкунаки паст барои ноил шудан ба баланд шудани ҳарорат дар зиёда аз чанд сад микрон бошад. Ин эҳтиёт бо коҳиши равшании фазоӣ ҳамроҳ мешавад, аммо агар ҳадаф омӯзиши ҳаракати микроорганизмҳо бошад, ҳалли баланди фазоӣ талаб карда намешавад.
Ҷадвали вақт барои гарм кардан (ва хунук кардани) система \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) аз андозаи он вобаста аст, тибқи қонун \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), ки \ (L\ ) андозаи хоси манбаи гармӣ (диаметри нури лазерӣ дар таҳқиқоти мо \(L\ тақрибан 100\) мкм), \(D\) диффузияи гармии муҳити зист (ба ҳисоби миёна дар мо Ҳолат, шиша ва об Суръати диффузия\(D\ тақрибан 2\ баробар {10}^{-7}\) м2/с). тағирёбии ҳароратро интизор шудан мумкин аст, ки ин як лаҳзаи баландшавии ҳарорат на танҳо давомнокии таҷрибаро кӯтоҳ мекунад, балки барои ҳар як омӯзиши динамикии таъсири ҳарорат вақти дақиқро \(t=0\) медиҳад.
Усули пешниҳодшудаи мо ба ҳама субстратҳои рӯшноӣ (масалан, намунаҳои тиҷоратӣ бо пӯшиши ITO) татбиқ карда мешавад. Бо вуҷуди ин, нанозарраҳои тилло қодиранд, ки азхудкунии баландро дар инфрасурх ва азхудкунии паст дар диапазони намоён таъмин кунанд, ки хусусиятҳои охирини онҳо барои мушоҳидаи самарабахши оптикӣ дар диапазони намоён, махсусан ҳангоми истифодаи флуоресцентҳо таваҷҷӯҳ доранд. Илова бар ин, тилло ба биологӣ мувофиқ аст, аз ҷиҳати кимиёвӣ ғайрифаъол аст, зичии оптикиро аз 530 нм то наздикии инфрасурх танзим кардан мумкин аст ва тайёр кардани намуна оддӣ ва сарфакор аст29.
Микроскопияи пеши мавҷҳои кундаланг (CGM) имкон медиҳад, ки на танҳо харитасозии ҳарорат дар миқёси микроскопӣ, балки инчунин мониторинги биомассаро анҷом дода, онро махсусан муфид (агар лозим набошад) дар якҷоягӣ бо LA-HTM кунад. Дар давоми даҳсолаи охир, усулҳои дигари микроскопияи ҳароратӣ, махсусан дар соҳаи биоimaging таҳия карда шуданд ва аксари онҳо истифодаи зондҳои флуоресцентии ба ҳарорат ҳассосро талаб мекунанд54,55. Бо вуҷуди ин, ин усулҳо танқид карда шуданд ва баъзе гузоришҳо тағироти ғайривоқеии ҳароратро дар дохили ҳуҷайраҳо чен кардаанд, эҳтимол аз он, ки флуорессенсия аз бисёр омилҳо ба ғайр аз ҳарорат вобаста аст. Илова бар ин, аксари зондҳои флуоресцентӣ дар ҳарорати баланд ноустуворанд. Аз ин рӯ, QPM ва махсусан CGM як усули идеалии микроскопияи ҳароратро барои омӯзиши ҳаёт дар ҳарорати баланд бо истифода аз микроскопияи оптикӣ муаррифӣ мекунанд.
Тадкикоти С.-и шибат, ки дар 80°С ба таври оптималй зиндагй мекунанд, нишон медихад, ки LA-HTM-ро барои омухтани гипертермофилхо истифода бурдан мумкин аст, на танхо термофилхои одди. Аслан, дар доираи ҳароратҳое, ки бо истифода аз LA-HTM ба даст овардан мумкин аст, маҳдудият вуҷуд надорад ва ҳатто ба ҳарорати аз 100 ° C болотар аз фишори атмосфера бидуни ҷӯш расидан мумкин аст, тавре ки гурӯҳи мо аз 38 дар барномаҳои химияи гидротермалӣ дар атмосфера нишон дод. фишори A. Лазер барои гарм кардани нанозаррачаҳои тиллоии 40 ҳамин тавр истифода мешавад. Ҳамин тариқ, LA-HTM дорои потенсиали барои мушоҳидаи гипертермофилҳои бесобиқа бо микроскопияи оптикии баландсифат дар шароити стандартӣ (яъне дар зери фишори муҳити зист) истифода мешавад.
Ҳама таҷрибаҳо бо истифода аз микроскопи хонагӣ, аз ҷумла равшании Köhler (бо LED, M625L3, Thorlabs, 700 мВт), дорандаи намуна бо ҳаракати дастӣ xy, ҳадафҳо (Olympus, 60x, 0,7 NA, ҳаво, LUCPlanFLN60X ё 60x, NA1il) анҷом дода шуданд. , UPLFLN60XOI), камераи CGM (QLSI чорчӯба, 39 мкм, 0,87 мм аз сенсори камераи Andor Zyla) барои таъмини шиддат ва тасвири пеши мавҷ ва камераи sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, режими 16-бит, аз Hamamatsu) барои сабт маълумот дар расми 5 нишон дода шудааст (шиноварии бактериявӣ). Тақсимкунандаи нури дихронӣ як канори BrightLine 749 нм мебошад (Semrock, FF749-SDi01). Филтр дар пеши камера як филтри кӯтоҳи 694 аст (FF02-694/SP-25, Semrock). Лазери сапфири титанӣ (Лазер Верди G10, 532 нм, 10 Вт, холигии лазерии сунамии насосӣ, Спектра-Физика дар расми 2-5, минбаъд бо лазери Millenia иваз карда шудааст, Spectraphysics 10 Вт, холигии лазерии Мира, Когерент барои Fig.2, -5). 6 ва 7) ба дарозии мавҷҳои \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) нм муқаррар карда шудаанд, ки ба спектри резонанси плазмони нанозарраҳои тилло мувофиқат мекунад Модуляторҳои нури фазоӣ (1920 × 1152 пиксел) аз Meadowlark Optics харида шудааст, ки голограммаҳо бо истифода аз алгоритми Gerchberg-Saxton, тавре ки дар истиноди 39 тавсиф шудааст, ҳисоб карда шуданд.
Микроскопияи пеши мавҷҳои салиб (CGM) як усули микроскопияи оптикӣ аст, ки ба омезиши панҷараи дифраксионии дученака (инчунин бо номи грати салиб маълум аст) дар масофаи як миллиметр аз сенсори муқаррарии камера асос ёфтааст. Намунаи маъмултарини CGM, ки мо дар ин тадқиқот истифода бурдем, интерферометри гузариш ба чор мавҷи дарозӣ (QLSI) номида мешавад, ки дар он грандчаҳо аз шакли тахтаи назорати шиддат/фазавӣ иборатанд, ки аз ҷониби Примот ва дигарон ворид ва патент шудааст. дар соли 200034. Хатҳои гринги амудӣ ва уфуқӣ дар сенсор сояҳои шабақро ба вуҷуд меоранд, ки таҳрифи онҳоро метавон дар вақти воқеӣ ба таври ададӣ коркард кард, то таҳрифи пеши мавҷҳои оптикӣ (ё профили фазаи муодили) нури афтанда ба даст ояд. Вақте ки дар микроскоп истифода мешавад, камераи CGM метавонад фарқияти роҳи оптикии объекти тасвиршударо, ки ҳамчун умқи оптикӣ (OT) низ маълум аст, бо ҳассосият аз рӯи тартиби нанометрҳо36 нишон диҳад. Дар ҳама гуна андозагирии CGM, барои бартараф кардани ҳама гуна нуқсонҳо дар ҷузъҳои оптикӣ ё чӯбҳо, бояд тасвири ибтидоии истинод ба OT гирифта шавад ва аз ҳама гуна тасвирҳои минбаъда тарҳ карда шавад.
Микроскопияи ҳарорат бо истифода аз камераи CGM, тавре ки дар истинод тавсиф шудааст, анҷом дода шуд. 32. Хулоса, гарм кардани моеъ шохиси шикастани онро таѓйир дода, эффекти линзаи гармиро ба вуљуд меорад, ки шуои њодисаро вайрон мекунад. Ин таҳрифи пеши мавҷ аз ҷониби CGM чен карда мешавад ва бо истифода аз алгоритми деконволютсионӣ коркард карда мешавад, то тақсимоти ҳароратро дар муҳити моеъ ба даст орад. Агар нанозаррачаҳои тилло дар тамоми намуна баробар тақсим карда шаванд, харитаи ҳароратро дар минтақаҳои аз бактерияҳо озод кардан мумкин аст, то тасвирҳои беҳтаре ба даст орем, ки мо баъзан коре мекунем. Тасвири истинод ба CGM бе гармкунӣ (бо лазер хомӯш) гирифта шуд ва баъдан дар ҳамон макони тасвир бо лазер фаъол карда шуд.
Андозаи массаи хушк бо истифода аз ҳамон камераи CGM, ки барои тасвири ҳарорат истифода мешавад, ба даст оварда мешавад. Тасвирҳои истинодҳои CGM тавассути интиқоли босуръати намуна дар x ва y ҳангоми экспозиция ҳамчун воситаи баҳодиҳии ҳама гуна номуайянӣ дар OT аз сабаби мавҷудияти бактерияҳо ба даст оварда шуданд. Аз тасвирҳои OT-и бактерияҳо, биомассаи онҳо бо истифода аз ансамбли тасвирҳо дар минтақаҳои интихобшуда бо истифода аз алгоритми сегментатсияи хонагии Matlab (ниг. ба зерфасли “Рамзи ададӣ”) мувофиқи тартиби дар истил. 48. Хулоса, мо муносибати \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}}-ро истифода мебарем. } x{{\mbox{d}}}y\), ки \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) тасвири умқи оптикӣ аст, \(m\) вазни хушк ва \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}}\) доимист. Мо \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg-ро интихоб кардем, ки доимии хос барои ҳуҷайраҳои зинда аст.
Лағжиши сарпӯши диаметри 25 мм ва ғафсиаш 150 мкм, ки бо нанозарраҳои тиллоӣ фаро гирифта шудааст, ба камераи AttofluorTM (Thermofisher) бо нанозаррачаҳои тилло рӯ ба боло гузошта шуд. Geobacillus stearothermophilus як шабонарӯз дар муҳити LB (200 rpm, 60 ° C) пеш аз ҳар рӯзи таҷрибаҳо парвариш карда шуд. Қатраи 5 мкл суспензияи G. stearothermophilus бо зичии оптикӣ (OD) аз 0,3 то 0,5 ба варақаи муқоваи нанозаррачаҳои тиллоӣ гузошта шуд. Сипас, ба болои қатра лӯлачаи мудаввари диаметраш 18 мм, ки дар маркази он сӯрохиаш 5 мм аст, партофта, ба маркази сӯрох такроран 5 мкл суспензияи бактериявӣ бо зичии оптикии якхела андохта шуд. Чоҳҳо дар болои пӯшишҳо мувофиқи тартиби дар ref. 45 (барои маълумоти бештар ба Маълумоти иловагӣ нигаред). Пас аз он ба пӯшиш 1 мл муҳити LB илова кунед, то ки қабати моеъ хушк нашавад. Либоси охирин болои сарпӯши пӯшидаи камераи Attofluor™ гузошта мешавад, то бухоршавии муҳити атроф ҳангоми инкубатсия пешгирӣ карда шавад. Барои тачрибахои нашъунамой мо спорахоеро истифода мебурдем, ки баъд аз тачрибахои мукаррарй баъзан кабати болоро мепушонанд. Барои ба даст овардани сульфолобус шибатае аз хамин усул истифода бурда шуд. Дар миёнаи 182 (DSMZ) культивацияи пешакии Thiobacillus serrata се рӯз (200 rpm, 75 ° C) гузаронида шуд.
Намунаҳои нанозаррачаҳои тиллоӣ тавассути литографияи сополимерии мицеллярӣ омода карда шуданд. Ин раванд дар боби муфассал тавсиф шудааст. 60. Мухтасар, мицеллахое, ки ионхои тиллоро капсул мекунанд, бо омехта кардани сополимер бо HAuCl4 дар толуол синтез карда шуданд. Пас аз он, пӯшишҳои тозашуда дар маҳлул ғарқ карда шуданд ва бо шуоъҳои ултрабунафш дар ҳузури агенти коҳишдиҳанда барои ба даст овардани тухмии тилло коркард карда шуданд. Ниҳоят, тухмии тилло тавассути тамос бо пӯшиш бо маҳлули обии KAuCl4 ва этаноламин дар тӯли 16 дақиқа парвариш карда шуд, ки дар натиҷа ҷойгиршавии квази-даврӣ ва хеле якхелаи нанозарраҳои тиллоии ғайрисферикӣ дар инфрасурх ба вуҷуд омад.
Барои табдил додани интерферограммаҳо ба тасвирҳои OT, мо алгоритми хонагиро истифода бурдем, ки дар истиноди муфассал оварда шудааст. 33 ва ҳамчун бастаи Matlab дар анбори оммавии зерин дастрас аст: https://github.com/baffou/CGMprocess. Маҷмӯа метавонад шиддат ва тасвирҳои OT дар асоси интерферограммаҳои сабтшуда (аз ҷумла тасвирҳои истинод) ва масофаҳои массиви камераро ҳисоб кунад.
Барои ҳисоб кардани намунаи марҳилае, ки ба SLM барои ба даст овардани профили ҳарорат истифода мешавад, мо алгоритми қаблан таҳияшудаи худсохти 39,42-ро истифода бурдем, ки дар анбори ҷамъиятии зерин дастрас аст: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Вуруд майдони ҳарорати дилхоҳ аст, ки онро ба таври рақамӣ ё тавассути тасвири монохромии bmp танзим кардан мумкин аст.
Барои тақсим кардани ҳуҷайраҳо ва чен кардани вазни хушки онҳо, мо алгоритми Matlab-и худро дар анбори оммавии зерин истифода кардем: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Дар ҳар як тасвир, корбар бояд бактерия ё mCFU-ро клик кунад, ҳассосияти чӯбро танзим кунад ва интихобро тасдиқ кунад.
Барои маълумоти бештар дар бораи тарҳрезии омӯзиш, ба реферат Ҳисоботи Тадқиқоти Табиат нигаред, ки ба ин мақола алоқаманд аст.
Маълумоте, ки натиҷаҳои ин тадқиқотро дастгирӣ мекунанд, аз муаллифони мувофиқ бо дархости асоснок дастрас мебошанд.
Рамзи сарчашмае, ки дар ин омӯзиш истифода шудааст, дар бахши Усулҳо муфассал оварда шудааст ва версияҳои ислоҳи ислоҳро аз https://github.com/baffou/ дар анборҳои зерин зеркашӣ кардан мумкин аст: SLM_temperatureShaping, CGMprocess ва CGM_magicWandSegmentation.
Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, AK Insight ба термофилҳо ва барномаҳои васеъи онҳо. Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, AK Insight ба термофилҳо ва барномаҳои васеъи онҳо.Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. ва Шарма, АК. Шарҳи термофилҳо ва истифодаи васеи онҳо. Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта, Р., Сингхал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК.Мехта Р., Сингхал П., Сингх Ҳ., Дамл Д. ва Шарма АК Фаҳмиши амиқ дар бораи термофилҳо ва доираи васеи барномаҳо.3 Биотехнология 6, 81 (2016).
Вақти фиристодан: сентябр-26-2022